Síntesis y Bioconjugation de tioles reactivos reactivos para la creación de sitio selectivamente modificados Immunoconjugates

Radiofármacos químicos durante mucho tiempo han explotado la selectividad y la especificidad de los anticuerpos de biomarcadores de la enfermedad para ambas imágenes nucleares y dirigidos radioterapia¹. Enfoque lejos más común para el radiolabeling de anticuerpos se basa en el acoplamiento indiscriminado de grupos prostéticos radiactivos o quelantes del radiometal a aminoácidos, a menudo lisinas — dentro de la estructura de la inmunoglobulina ( Figura 1A)². Mientras que esta estrategia es ciertamente efectiva, su naturaleza aleatoria, sitio-específica puede crear problemas. Específicamente, bioconjugation tradicionales enfoques producen poco definido y immunoconjugates heterogéneo compuesto por mezclas de miles de regioisomers diferentes, cada uno con su propio conjunto de propiedades biológicas y farmacológicas³. Además, al azar bioconjugation puede impedir el immunoreactivity de anticuerpos si la carga se anexa a los dominios de unión a antígeno de la inmunoglobulina.

Con los años, han desarrollado una variedad de estrategias bioconjugation específico y selectivo de sitio para hacer frente a estos problemas^4,5. El más común de estos enfoques se basa en la ligación de sondas de maleimida-teniendo a los grupos sulfidrilo de cisteínas (figura 1B). Anticuerpos IgG1 naturalmente contienen 4 puentes disulfuro inter-cadena, vínculos que pueden reducirse selectivamente para producir tioles libres capaces de sufrir reacciones de adición de Michael con maleimides para formar succinimidyl thioether bonos. El uso de tioles y maleimides es sin duda una mejora sobre los métodos tradicionales y una gran variedad de rodamientos de maleimida sintones y quelantes bifuncionales están actualmente disponibles. Sin embargo, es importante señalar que esta metodología tiene también serias limitaciones. Immunoconjugates base de maleimida exhiben estabilidad limitada en vivo porque el vínculo thioether puede experimentar una reacción de retro-Michael (figura 2)^{6,7,8,9, 10}. esto, por supuesto, puede conducir a la liberación de la carga radiactiva o su intercambio con biomoléculas de tiol-rodamiento en la circulación (por ejemplo, glutatión o albúmina sérica). Ambos de estos procesos pueden aumentar las concentraciones de actividad en órganos sanos así como disminuir las concentraciones de actividad en los tejidos diana, dando por resultado contraste imagen reducida y menores relaciones terapéuticas. Varios reactivos de tioles reactivos alternativos se han desarrollado en un esfuerzo para evitar estos problemas, incluyendo tosylates, bromo y iodo acetyls y vinilo Sulfonas^{11,12,13, 14 , 15 , 16 , 17}. sin embargo, todos estos enfoques tienen limitaciones que han obstaculizado su aplicación generalizada.

Aproximadamente hace cinco años, el laboratorio de la tarde Carlos III de Barbas en el Scripps Research Institute fue pionero en el uso de Sulfonas de metilo phenyloxadiazolyl como reactivos para la formación selectiva de vínculos muy estables con los tioles (figura 1 y figura 3) ^{18 , 19}. los autores emplean una variante de rodamiento de sulfona de metil phenyloxadiazolyl de fluoresceína a modificar varios anticuerpos diseñados para contener residuos de cisteína libre, produciendo en última instancia immunoconjugates con mayor estabilidad que el análogo construcciones creadas utilizando sondas de maleimida. Al ver este trabajo prometedor, nos sorprendió un poco que esta tecnología se ha utilizado apenas en radioquímica y no había aún sido utilizada en todos en la síntesis de quelantes bifuncionales o radioimmunoconjugates^20,21 . Esta escasez de aplicaciones, sin embargo, pronto comenzó a tener más sentido: varios intentos de procurar el reactivo de Sigma-Aldrich dio lugar a la recepción de mezclas complejas de productos de degradación con < 15% del compuesto deseado. Además, sintetizando el reactivo informó nosotros mismos no era una opción realista, como la ruta sintética publicada es algo engorrosa y requiere de equipo sofisticado de química orgánica que mayoría de radioquímica y la proyección de imagen molecular laboratorios, incluido el nuestro — simplemente no poseen.

En respuesta a estos obstáculos, nos propusimos crear una fácilmente accesible y altamente estable reactivo de phenyloxadiazolyl metil sulfona que puede obtenerse a través de una ruta sintética razonablemente fácil y robusta. Este año, informó de la creación de un modular, estable y fácilmente accesible phenyloxadiazolyl metil sulfona reactivo — apodado ‘Vainas’ — como una plataforma para el²²de bioconjugations basados en tiol (figura 1 y figura 3). La diferencia clave entre las vainas y el reactivo reportado por Barbas, et al es que el primero emplea un anilina anillo unido a la molécula de sulfona de phenyloxadiazolyl metílico, mientras que este último cuenta con un fenol en la misma posición (figura 4). Este cambio facilita una ruta sintética más sencilla y accesible, así como — si nuestra experiencia con el compuesto comercialmente disponible es emblemático, un reactivo final más estable. En este trabajo, sintetiza también un par de vainas-cojinete quelantes bifuncionales, DFO de vainas y vainas-CHX-A”-DTPA — para facilitar la creación de ⁸⁹Zr – y ¹⁷⁷marcado con Lu radioimmunoconjugates, respectivamente. Como vamos a discutir, hemos demostrado que bioconjugations sitio selectiva basada en las vainas reproducible y robusto crear radioimmunoconjugates homogénea, bien definida, altamente immunoreactive y muy estable. Además, los experimentos preclínicos en modelos murinos de cáncer colorrectal han demostrado que estos sitio selectivamente con la etiqueta radioimmunoconjugates exposición rendimiento en vivo superior en comparación con los anticuerpos radiactivos sintetizados vía base de maleimida conjugaciones.

El objetivo primordial de este trabajo es facilitar la creación de immunoconjugates bien definida, homogénea, muy estable y altamente immunoreactive para aplicaciones in vitro e in vivo. El enfoque sintético es simple de realizar en casi cualquier laboratorio, y el reactivo de las vainas de los padres puede modificarse con una plétora de diferentes quelantes, fluoróforos o cargas. En este protocolo y el video que lo acompaña, describimos la síntesis simple de cuatro pasos de vainas (figura 5); la creación de una variante de rodamiento de las vainas de DOTA, un quelante utilizado para la coordinación de ⁶⁴Cu ⁶⁸Ga, ¹¹¹en ¹⁷⁷Lu y ²²⁵Ac (figura 6); y el bioconjugation de vainas DOTA a un anticuerpo de la modelo, el trastuzumab IgG1 dirigidos a la HER2 (figura 7).