Sentez ve Site seçici olarak oluşturulması için Thiol reaktif reaktif Bioconjugation Immunoconjugates modifiye
Summary
Bu protokol için biz BAKLA, bir phenyoxadiazolyl metil sulfone tabanlı reaktif yükler site seçici bağlantı için biomolecules, özellikle antikorlar thiols sentezi anlatacağız. Buna ek olarak, biz malzemelerin ve BAKLA taşıyan bifonksiyonel şelatör ve onun konjugasyon bir modeli antikor için anlatacağız.
Abstract
Maleimide taşıyan bifonksiyonel sonda thiols biomolecules, özellikle antikorlar içinde site seçici modifikasyonu için yıllardır istihdam edilmiştir. Succinimidyl thioether bağlantı bir retro-Michael tepki tabi olabilir, çünkü henüz maleimide tabanlı conjugates sınırlı istikrar içinde vivo görüntüleyebilir. Bu, tabii ki, radyoaktif payload ya da onun exchange thiol taşıyan biomolecules dolaşımı ile sürümü yol açabilir. Bu işlemlerden her ikisi de sağlıklı organlar konsantrasyonlarda yükseltilmiş etkinlik üretebilir yanı sıra hedef dokular, azaltılmış görüntüleme kontrast ve alt terapötik oranları ile sonuçlanan faaliyet konsantrasyonlarda azalmıştır. 2018 yılında, biz modüler, istikrarlı ve kolayca erişilebilir phenyloxadiazolyl metil sulfone reaktif rapor — ‘BAKLA’ lakaplı — thiol tabanlı bioconjugations için bir platform olarak. BAKLA tabanlı site seçici bioconjugations homojen, iyi tanımlanmış, son derece immunoreactive ve son derece istikrarlı radioimmunoconjugates tekrarlanarak ve sağlam oluşturmak açıkça göstermiştir. Ayrıca, kolorektal kanser fare modelleri preklinik deneylerde bunlar sitesi-seçici radiolabeled antikorların sentez maleimide tabanlı yolu ile karşılaştırıldığında sergi çok daha üstün içinde vivo performans radioimmunoconjugates etiketli göstermiştir conjugations. Bu protokol için biz BAKLA, her yerde şelatör DOTA (BAKLA-DOTA) bifonksiyonel BAKLA taşıyan türevini ve BAKLA-DOTA konjugasyon HER2 hedefleme antikor trastuzumab için dört adımlı sentezi anlatacağız.
Introduction
Proton kimyagerler kadar seçicilik ve biyolojik hastalık her iki Nükleer görüntüleme için antikor özgüllüğü istismar ve radyoterapi1hedef. Sıra radiolabeling bir farkla en yaygın yaklaşım amino asitler için radiolabeled prostetik gruplar veya radiometal şelatörlerin eki gelişigüzel esas olan — en sık lysines — ( immünglobulin yapısı içinde Şekil 1A)2. Bu strateji kesinlikle etkili olmakla birlikte, rastgele, site özel olmayan doğası sorunlar oluşturabilir. Özellikle, kötü tanımlı geleneksel bioconjugation yaklaşımlar üretmek ve karışımları farklı regioisomers, her biri kendi kümesini biyolojik ve farmakolojik özellikleri3binlerce heterojen immunoconjugates oluşur. Ayrıca, kargo immünglobulin’ın antijen bağlayıcı etki alanlarına eklenir eğer rastgele bioconjugation antikorlar immunoreactivity engelleyebilir.
Yıllar içinde siteye özgü ve site-seçici bioconjugation stratejileri çeşitli sahip geliştirilen bu sorunları4,5gidermek için. Bu yaklaşımların en yaygın maleimide taşıyan problar katıldı (şekil 1B) sulfhydryl grupları için ligasyonu kullanır. Igg1 antikorlar doğal olarak 4 arası zinciri disülfür köprü, seçmeli olarak ücretsiz thiols Michael ek tepkiler maleimides succinimidyl thioether bağlar ile geçiyor yetenekli vermeye azaltılabilir bağlantıları içerir. Thiols ve maleimides kullanımı kesinlikle geleneksel yöntemleri üzerinde bir gelişme ve çok çeşitli maleimide taşıyan synthons ve bifonksiyonel şelatörlerin şu anda kullanılabilir. Ancak, bu yöntem de ciddi sınırlamaları olduğunu unutmamak gerekir. Thioether bağlantı bir retro-Michael reaksiyon (Şekil 2)6,7,8,9, tabi olabilir çünkü sınırlı istikrar içinde vivo Maleimide tabanlı immunoconjugates sergi 10. bu, tabii ki, radyoaktif payload ya da thiol taşıyan biomolecules dolaşımı (örneğin, glutatyon veya serum albümin) ile onun exchange sürümü yol açabilir. Bu işlemlerin her ikisini de sağlıklı organlar konsantrasyonlarda etkinliği artırmak olarak hedef dokular, azaltılmış görüntüleme kontrast ve alt terapötik oranları ile sonuçlanan faaliyet konsantrasyonlarda azaltmak. Birkaç alternatif thiol reaktif reaktif bir çaba tosylates, bromo ve iodo acetyls ve vinil sulfones11,12,13, de dahil olmak üzere bu sorunları aşmak için geliştirilmiştir 14 , 15 , 16 , 17. ancak, tüm bu yaklaşımların yaygın uygulama engel kısıtlamalar bulunmaktadır.
Yaklaşık beş yıl önce geç Carlos Barbas III Scripps Araştırma Enstitüsü’nde laboratuvar phenyloxadiazolyl metil sulfones kullanımı olarak thiols (şekil 1 c ve şekil 3) ile son derece kararlı bağlantıları seçici oluşumu Kimyasalları kurulmasına öncülük 18 , 19. sonuçta benzer daha yüksek istikrar ile immunoconjugates üreten floresein ücretsiz sistein kalıntıları, içerecek şekilde tasarlanmış birkaç antikorlar değiştirmek için bir phenyloxadiazolyl metil sulfone taşıyan türevi yazarlar istihdam maleimide tabanlı probları kullanılarak oluşturulan yapıları. Bu umut verici iş görme üzerine, biz bu teknoloji sadece pek radiochemistry kullanılmaya başlanmış ve henüz hiç bifonksiyonel şelatörlerin veya radioimmunoconjugates20,21 sentezinde kullanılır olmuştu değil biraz şaşırdık . Uygulamalar, ancak, bu eksiklik yakında daha fazla anlam ifade etmeye başladı: bozulma ürünleri ile karmaşık karışımlar alınmasından reaktif Sigma-Aldrich tedarik çeşitli girişimler sonuçlandı < istenen bahçedeki % 15. Yayımlanmış sentetik yolun biraz hantal ve karmaşık organik kimya donatım gerektirir gibi Ayrıca, bildirilen reaktif kendimizi sentezleme gerçekçi bir seçenek de, değildi bu en radiochemistry ve moleküler görüntüleme laboratuvarlar — bizim de dahil olmak üzere — sadece sahip olmayan.
Bu engelleri yanıt olarak, biz kolayca erişilebilir oluşturmak ve son derece güçlü ve makul facile sentetik rota yolu ile elde edilebilir phenyloxadiazolyl metil sulfone reaktif istikrarlı için yola çıktı. Bu yılın başlarında, biz modüler, istikrarlı ve kolayca erişilebilir phenyloxadiazolyl metil sulfone reaktif rapor — ‘BAKLA’ lakaplı — thiol tabanlı bioconjugations (şekil 1 c ve şekil 3)22için bir platform olarak. BAKLA ve reaktif arasındaki en önemli fark Barbas tarafından bildirilen vd. eski ikinci bir fenol (şekil 4) aynı konumda bulunuyor iken phenyloxadiazolyl metil sulfone yan için bağlı bir anilin yüzüğü istihdam olduğunu. Bir daha basit ve erişilebilir sentetik yolu bu değişiklik kolaylaştırır hem de — piyasada bulunan bileşik ile bizim deneyim sembolik ise — daha istikrarlı bir son reaktif. Bu çalışmada, ayrıca BAKLA taşıyan bifonksiyonel şelatörlerin çifti sentezlenmiş — BAKLA-DFO ve BAKLA-CHX-A”-DTPA — 89Zr – ve 177radioimmunoconjugates Lu etiketli, sırasıyla kolaylaştırmak için. Biz tartışacağız gibi biz PODS tabanlı site seçici bioconjugations homojen, iyi tanımlanmış, son derece immunoreactive ve son derece istikrarlı radioimmunoconjugates tekrarlanarak ve sağlam oluşturmak gösterdi. Ayrıca, kolorektal kanser fare modelleri preklinik deneylerde bunlar sitesi-seçici radiolabeled antikorların sentez maleimide tabanlı yolu ile karşılaştırıldığında sergi üstün içinde vivo performans radioimmunoconjugates etiketli göstermiştir conjugations.
Bu eser aşırı kemer iyi tanımlanmış, homojen, son derece istikrarlı ve son derece immunoreactive immunoconjugates tüp bebek ve içinde vivo uygulamaların oluşturulmasını kolaylaştırmak için hedeftir. Sentetik yaklaşım neredeyse herhangi bir laboratuvarda gerçekleştirilecek basit ve üst BAKLA reaktif farklı şelatörlerin, fluorophores veya yükleri bir bolluk ile değiştirilebilir. Bu iletişim kuralı ve beraberindeki video, BAKLA (şekil 5); basit, dört adımlı bir sentez anlatacağım DOTA, 64Cu koordinasyonu, 68Ga, 111, 177Lu ve 225Ac (şekil 6); için yaygın olarak kullanılan bir şelatör BAKLA taşıyan türevi oluşturulması ve BAKLA-DOTA bioconjugation için bir model antikor, Igg1 HER2 hedefleme trastuzumab (Şekil 7).
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu raporda, radiolabeling veya içinde vivo deneyler için herhangi bir iletişim kuralı eklemeyi seçtiniz. Bizim basit nedenidir. Eski ile ilgili olarak, BAKLA tabanlı immunoconjugate radiolabeling hiç, diğer bioconjugation stratejileri kullanarak sentezlenmiş bir immunoconjugate farklı değil ve bu yordamları kapsamlı olmuştur başka bir yerde2 gözden . İkincisi ile ilgili olarak, preklinik içinde vivo deneyler (fare modelleri, doz, vb), özellikleri geniş uygulama ve antikor/antij…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Dr Sai Kiran Sharma yararlı konuşmaları için teşekkür ederiz.
Materials
| 5-(4-aminophenyl)-1,3,4-oxadiazole-2-thiol | Sigma-Aldrich | 675024 | |
| 1.5 mL LoBind Microcentrifugal Tube | Eppendorf | 925000090 | |
| 1.5 mL Microcentrifugal Tube | Fisherbrand | 05-408-129 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit | EMD Millipore | EN300000141G | |
| Cyclohexane | Fisher Scientific | C556-4 | |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | AC383780010 | |
| Diisopropylethylamine | MP Biomedicals, LLC | 150915 | |
| Dimethylsulfoxide | Fisher Scientific | 31-727-5100ML | |
| Ethyl Acetate | Fisher Scientific | E145 4 | |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | |
| Iodomethane | Sigma-Aldrich | 289566-100G | |
| Magnesium Sulfate | Acros Organics | 413485000 | |
| m-chloroperbenzoic acid | Sigma-Aldrich | 273031 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412 1 | |
| NBoc-N′-succinyl-4,7,10-trioxa-1,13-tridecanediamine | Sigma-Aldrich | 671401 | Store at -80 °C |
| N-ethyl-N′- [3- (dimethylamino)propyl] carbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 3450 | |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | P5493 | 10× Concentration |
| p-SCN-Bn-DOTA | Macrocyclics | B-205 | Store at -80 °C |
| Sephadex G-25 in PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare | 17085101 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795 | |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| TCEP | ThermoFischer Scientific | 20490 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | AC157911000 | |
| Trifluoroacetic Acid | Fisher Scientific | A116-50 |
References
- Wu, A. M. Antibodies and antimatter: The resurgence of immuno-PET. Journal of Nuclear Medicine. 50 (1), 2-5 (2009).
- Zeglis, B. M., Lewis, J. S. A practical guide to the construction of radiometallated bioconjugates for positron emission tomography. Dalton Transactions. 40 (23), 6168-6195 (2011).
- Agarwal, P., Bertozzi, C. R. Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjugate Chemistry. 26 (2), 176-192 (2015).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 1: Cysteine residues and glycans. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 1-17 (2016).
- Adumeau, P., Sharma, S. K., Brent, C., Zeglis, B. M. Site-specifically labeled immunoconjugates for molecular imaging-part 2: Peptide tags and unnatural amino acids. Molecular Imaging and Biology. 18 (1), 153-165 (2016).
- Alley, S. C., et al. Contribution of linker stability to the activities of anticancer immunoconjugates. Bioconjugate Chemistry. 19 (3), 759-765 (2008).
- Baldwin, A. D., Kiick, K. L. Tunable degradation of maleimide-thiol adducts in reducing environments. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1946-1953 (2011).
- Shen, B. -. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nature Biotechnology. 30 (2), 184-189 (2012).
- Jackson, D., et al. In vitro and in vivo evaluation of cysteine and site specific conjugated herceptin antibody-drug conjugates. Plos One. 9 (1), (2014).
- Ponte, J. F., et al. Understanding how the stability of the thiol-maleimide linkage impacts the pharmacokinetics of lysine-linked antibody-maytansinoid conjugates. Bioconjugate Chemistry. 27 (7), 1588-1598 (2016).
- Stimmel, J. B., et al. Site-specific conjugation on serine -> cysteine variant monoclonal antibodies. Journal of Biological Chemistry. 275 (39), 30445-30450 (2000).
- Li, L., et al. Reduction of kidney uptake in radiometal labeled peptide linkers conjugated to recombinant antibody fragments. site-specific conjugation of DOTA-peptides to a cys-diabody. Bioconjugate Chemistry. 13 (5), 985-995 (2002).
- Li, J., Wang, X. H., Wang, X. M., Chen, Z. L. Site-specific conjugation of bifunctional chelator BAT to mouse IgG(1) Fab’ fragment. Acta Pharmacologica Sinica. 27 (2), 237-241 (2006).
- Tinianow, J. N., et al. Site-specifically Zr-89-labeled monoclonal antibodies for ImmunoPET. Nuclear Medicine and Biology. 37 (3), 289-297 (2010).
- Li, L., et al. Site-specific conjugation of monodispersed DOTA-PEGn to a thiolated diabody reveals the effect of increasing PEG size on kidney clearance and tumor uptake with improved 64-copper PET imaging. Bioconjugate Chemistry. 22 (4), 709-716 (2011).
- Khalili, H., Godwin, A., Choi, J. -. w., Lever, R., Brocchini, S. Comparative binding of disulfide-bridged PEG-Fabs. Bioconjugate Chemistry. 23 (11), 2262-2277 (2012).
- Koniev, O., Wagner, A. Developments and recent advancements in the field of endogenous amino acid selective bond forming reactions for bioconjugation. Chemical Society Reviews. 44 (15), 5495-5551 (2015).
- Patterson, J. T., Asano, S., Li, X., Rader, C., Barbas, C. F. Improving the serum stability of site-specific antibody conjugates with sulfone linkers. Bioconjugate Chemistry. 25 (8), 1402-1407 (2014).
- Toda, N., Asano, S., Barbas, C. F. Rapid, stable, chemoselective labeling of thiols with Julia-Kocienski-like reagents: A serum-stable alternative to maleimide-based protein conjugation. Angewandte Chemie-International Edition. 52 (48), 12592-12596 (2013).
- Zhang, Q., et al. Last-step enzymatic F-18-fluorination of cysteine-tethered RGD peptides using modified Barbas linkers. Chemistry-a European Journal. 22 (31), 10998-11004 (2016).
- Chiotellis, A., et al. Novel chemoselective F-18-radiolabeling of thiol-containing biomolecules under mild aqueous conditions. Chemical Communications. 52 (36), 6083-6086 (2016).
- Adumeau, P., Davydova, M., Zeglis, B. M. Thiol-reactive bifunctional chelators for the creation of site-selectively modified radioimmunoconjugates with improved stability. Bioconjugate Chemistry. 29, 1364-1372 (2018).
- Sakamoto, J., Kojima, H., Kato, J., Hamashima, H., Suzuki, H. Organ-specific expression of the intestinal epithelium-related antigen A33, a cell surface target for antibody-based imaging and treatment in gastrointestinal cancer. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 46, S27-S32 (2000).
- Sakamoto, J., et al. A phase I radioimmunolocalization trial of humanized monoclonal antibody huA33 in patients with gastric carcinoma. Cancer Science. 97 (11), 1248-1254 (2006).
- Junutula, J. R., et al. Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index. Nature Biotechnology. 26 (8), 925-932 (2008).
- Pillow, T. H., et al. Site-specific trastuzumab maytansinoid antibody-drug conjugates with improved therapeutic activity through linker and antibody engineering. Journal of Medicinal Chemistry. 57 (19), 7890-7899 (2014).
- Boswell, C. A., et al. Enhanced tumor retention of a radiohalogen label for site-specific modification of antibodies. Journal of Medicinal Chemistry. 56 (23), 9418-9426 (2013).
- Boswell, C. A., et al. Impact of drug conjugation on pharmacokinetics and tissue distribution of anti-STEAP1 antibody-drug conjugates in rats. Bioconjugate Chemistry. 22 (10), 1994-2004 (2011).
- Alvarez, V. L., et al. Site-specifically modified 111In labelled antibodies give low liver backgrounds and improved radioimmunoscintigraphy. Nuclear Medicine and Biology. 13 (4), 347-352 (1986).
- Strop, P., et al. Location matters: SIte of conjugation modulates stability and pharmacokinetics of antibody drug conjugates. Chemistry, Biology. 20 (2), 161-167 (2013).
- Hallam, T. J., Wold, E., Wahl, A., Smider, V. V. Antibody conjugates with unnatural amino acids. Molecular Pharmaceutics. 12 (6), 1848-1862 (2015).
- Axup, J. Y., et al. Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (40), 16101-16106 (2012).
- Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
- Yamasaki, R. B., Osuga, D. T., Feeney, R. E. Periodate oxidation of methionine in proteines. Analytical Biochemistry. 126 (1), 183-189 (1982).
- Wang, W., et al. Impact of methionine oxidation in human IgG1 Fc on serum half-life of monoclonal antibodies. Molecular Immunology. 48 (6-7), 860-866 (2011).
- O’Shannessy, D. J., Dobersen, M. J., Quarles, R. H. A novel procedure for labeling immunoglobulins by conjugation to oligosaccharide moieties. Immunology Letters. 8 (5), 273-277 (1984).
- Panowski, S., Bhakta, S., Raab, H., Polakis, P., Junutula, J. R. Site-specific antibody drug conjugates for cancer therapy. Mabs. 6 (1), 34-45 (2014).
- Hu, M. D., et al. Site-specific conjugation of HIV-1 tat peptides to IgG: a potential route to construct radioimmunoconjugates for targeting intracellular and nuclear epitopes in cancer. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 33 (3), 301-310 (2006).
