Un enfoque estandarizado para la purificación multiespecífica de células germinales masculinas de mamíferos por disociación mecánica de tejidos y citometría de flujo
Summary
Este trabajo describe la estandarización de un método para obtener poblaciones de células germinales purificadas de tejido testicular de diferentes especies de mamíferos. Es un protocolo directo que combina la disociación mecánica de los testículos, la tinción con Hoechst-33342 y el yoduro de propidio, y la clasificación FACS, con amplias aplicaciones en estudios comparativos de la biología reproductiva masculina.
Abstract
Clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) ha sido uno de los métodos de elección para aislar las poblaciones enriquecidas de células germinales testiculares de mamíferos. Actualmente, permite la discriminación de hasta 9 poblaciones de células germinales murinas con alto rendimiento y pureza. Esta alta resolución en la discriminación y purificación es posible debido a cambios únicos en la estructura de la cromatina y la cantidad a lo largo de la espermatogénesis. Estos patrones pueden ser capturados por citometría de flujo de células germinales masculinas teñidas con colorantes fluorescentes de unión a ADN tales como Hoechst-33342 (Hoechst). En este documento se describe detalladamente un protocolo recientemente desarrollado para aislar células germinales testiculares de mamíferos. En pocas palabras, las suspensiones de células individuales se generan a partir de tejido testicular por disociación mecánica, se tiñen doblemente con Hoechst y yoduro de propidio (PI) y se procesan mediante citometría de flujo. Una estrategia de gating serie, incluida la selección de células vivas (PI negativo) con diferentes contenidos de ADN (Hoechst intensidad), iS utilizados durante la clasificación FACS para discriminar hasta 5 tipos de células germinales. Estos incluyen, con las correspondientes purezas medias (determinadas por la evaluación microscópica): espermatogonias (66%), espermatocitos primarios (71%) y secundarios (85%) y espermátides (90%), (87%) subpoblaciones. La ejecución de todo el flujo de trabajo es sencilla, permite el aislamiento de 4 tipos de células simultáneamente con la máquina FACS apropiada y se puede realizar en menos de 2 h. A medida que el tiempo de procesamiento es crucial para preservar la fisiología de las células ex vivo , este método es ideal para estudios de alto rendimiento a la baja de la biología de células germinales masculinas. Además, un protocolo estandarizado para la purificación multiespecies de células germinales de mamíferos elimina fuentes metodológicas de variables y permite un único conjunto de reactivos para diferentes modelos animales.
Introduction
Dada la ausencia de un sistema in vitro representativo de la progresión de la espermatogénesis y la presencia de gran heterogeneidad celular en los testículos, los estudios de la biología de células germinales masculinas requieren técnicas robustas para aislar poblaciones enriquecidas de tipos celulares específicos. La clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) ha sido ampliamente utilizada para este propósito 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , ya que proporciona alto rendimiento y pureza y supera otros métodos de aislamiento en el número de tipos de células germinales que puede identificar y Seleccione 6 , 7 , 8 . El principio del análisis de citometría de flujo se basa en la detección de patrones de luz diferenciales después de la excitación por haz láser de células individuales. Como una célula pasa a través del láser que refleja / dispersa la luzEn todos los ángulos, proporcional al tamaño de la célula (dispersión hacia delante, FSC) ya la complejidad intracelular (dispersión lateral, SSC). Ver Ormerod 9 para información detallada sobre citometría de flujo.
Las células germinales masculinas experimentan modificaciones específicas en el contenido de ADN, estructura de la cromatina, tamaño y forma a lo largo de diferentes etapas de la espermatogénesis. Por lo tanto, distintas poblaciones de células pueden ser identificados y separados por la combinación de la dispersión de la luz y la tinción del ADN con colorantes fluorescentes [ 10 , 11] . Para este propósito se pueden utilizar varios tintes (revisado en Geisinger y Rodriguez-Casuriaga 3 ), como Hoechst-33342 (Hoechst), que se ha utilizado con frecuencia en el análisis de citometría de flujo de células testiculares durante la última década 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN con luz UV, Hoechst emite fluorescencia azul proporcional al contenido de ADN celular, mientras que la fluorescencia de color rojo refleja la variabilidad en la estructura de la cromatina y la compactación [ 1 , 13 , 14] . Como resultado, las células germinales masculinas en diferentes etapas de diferenciación exhiben patrones específicos durante FACS de suspensiones de células individuales teñidas con Hoechst (Ho-FACS; 1 , 12 ). Curiosamente, debido a un mecanismo de eflujo de colorante que sólo es activo durante la etapa espermatogonal, la intensidad de fluorescencia azul Hoechst no es proporcional al contenido de cromatina en estas células, y se agrupan como una población lateral durante Ho-FACS [ 15] . Además, al combinar la tinción Hoechst con el yoduro de propidio (PI) no permeante, los usuarios pueden discriminar las células vivas (PI negativas) de las células muertas (PI positivas) durante FACS 1 <Sup>, 2 , 10 , 12 . Esta estrategia se ha utilizado previamente en citometría de flujo análisis de las células germinales testiculares y optimizado extensivamente en el ratón para discriminar hasta 9 tipos de células germinales, incluyendo las células en 4 diferentes etapas de meiosis I 1, 2, 4, 16. Para los fines de este trabajo, la tinción Hoechst tiene tres ventajas principales. En primer lugar, Ho-FACS se ha aplicado con éxito al aislamiento de células germinales masculinas en el ratón modelo 1 , 2 , 12 , y otros roedores, tales como rata y cobaya 17 , 18 , 19 . En segundo lugar, Hoechst es un colorante permeante a las células y no requiere permeabilización de la membrana, por lo que preservarLa integridad celular. Por último, no se requiere ningún tratamiento con RNasa ya que Hoechst se une preferentemente a las secuencias de ADN poli (d [AT]) 1 , 20 , lo que significa que el ARN se conserva y, además del ADN y las proteínas, puede usarse para estudios moleculares posteriores del germen diferenciación celular.
A pesar de la similitud en la ploidía del ADN y / o la capacidad de tinción observada en los análisis de citometría de flujo de especies de mamíferos (revisado en Geisinger y Rodriguez-Casuriaga 3 ), ha habido una gran variabilidad en los protocolos descritos para el aislamiento de células germinales masculinas por citometría de flujo. Diferentes estudios han empleado protocolos específicos para la disociación de tejidos, y se utilizaron distintos colorantes de unión a ADN (solo o en combinación) y FACS en diferentes organismos modelo, principalmente el ratón, la rata y el cobayo. Por lo tanto, la comparación directa de los datos recogidos para diferentes especies puede verse afectada por elLos artefactos técnicos resultantes de la variabilidad entre metodologías. Es importante destacar que la sorprendente conservación de la dinámica de la cromatina a lo largo de la espermatogénesis de los mamíferos (2N-4N-2N-1N) sugiere que un protocolo estandarizado podría aplicarse transversalmente a una variedad de especies de mamíferos.
El objetivo de este estudio fue desarrollar un único flujo de trabajo que sea aplicable a diferentes especies de mamíferos, combinando y adaptando técnicas previamente publicadas 2 , 20 . La normalización de un método para el procesamiento de tejidos se logró mediante la disociación mecánica para superar la necesidad de ajustes específicos de la especie necesaria para la digestión enzimática [ 5] . Es de destacar que la disociación mecánica del tejido testicular de roedor se ha demostrado que tiene un mejor comportamiento que la digestión enzimática del tejido 20 y Ho-FACS de suspensiones de células individuales generadas por ambos métodos expResultados comparables 5 . Como prueba de principio, este protocolo describe los parámetros utilizados para aislar hasta 5 poblaciones de células germinales: la espermatogonía (SPG); Primaria (SPC I) y espermatocitos secundarios (SPC II), y espermátides (SPD) – ronda (rSPD) y alargamiento (eSPD). Es importante destacar que es fácil de implementar en el laboratorio, siendo los principales requisitos el sistema para la disociación de tejidos y el acceso a un clasificador de células equipado con un láser UV. Este flujo de trabajo ( Figura 1 ) es rápido y directo y permite el aislamiento simultáneo de 4 poblaciones de células germinales de tejido testicular fresco en menos de 2 h. El tiempo de procesamiento reducido es crucial para mantener la integridad celular para procedimientos posteriores. Además, su exitoso rendimiento en 5 especies diferentes sugiere que podría aplicarse ampliamente en el clado de mamíferos, lo que lo convierte en el método ideal para aislar las células germinales para estudios comparativos de mamíferos biológicos reproductivos masculinosCión.
Este protocolo se compone de tres secciones principales, aparte de los pasos preparatorios: (1) la disociación mecánica del tejido testicular y (2) tinción de células testiculares con Hoechst y PI, seguido de (3) clasificación FACS de células espermatogénicas relevantes. Una vez recogidas, estas poblaciones enriquecidas de diferentes células germinales testiculares de mamíferos pueden usarse para una amplia gama de aplicaciones. Este protocolo describe un método de disociación "de tamaño único" para purificar las células germinales masculinas de muchas especies diferentes de mamíferos. Dependiendo del tipo de estudio que los usuarios deseen realizar con las células germinales aisladas, pueden utilizarse otros medios o tampones. Los siguientes pasos del protocolo son para generar suspensiones de células únicas de un testículo entero de murino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Teniendo en cuenta la dinámica de la cromatina altamente conservada durante la espermatogénesis en los mamíferos, el objetivo de este trabajo fue desarrollar un protocolo para aislar las células germinales masculinas en distintas etapas de diferenciación de diferentes tejidos testiculares de mamíferos ( Figura 1 ). Uno de los principales obstáculos en la aplicación de un único flujo de trabajo a diferentes modelos animales es la necesidad de ajustes específicos de la especie, espe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen al hospital animal de la ladera (St. Louis, MO) para los testículos del perro; Jason Arand y el laboratorio del Dr. Ted Cicero en la Universidad de Washington en St. Louis (WashU) por proporcionar testículos de rata y Tabers Brianne para ayudar con la colección; Jared Hartsock y el Dr. Salt's Lab en WashU para los testículos de cobaya; Y el Dr. Michael Talcott en la División de Medicina Comparada en WashU para el testículo de cerdo en miniatura. Los autores también reconocen Alvin J. Siteman Cancer Center en la Escuela de Medicina de la Universidad de Washington y Barnes-Jewish Hospital en St. Louis, MO, para el uso del Siteman Flow Cytometry Core, que proporcionó servicio de clasificación de células operado por el personal. El Siteman Cancer Center es apoyado en parte por el NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842.
Esta investigación fue financiada por una beca de doctorado de la FCT [SFRH / BD / 51695/2011 a ACL], subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos [R01HD078641 y R01MH101810 a DFC] y un contrato de investigación de la FCT [IF / 01262/2014 a AML].
Materials
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS ceollction |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
- Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A., Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
- Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
- Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
- Lassalle, B., et al. ‘Side Population’ cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
- Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
- Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
- Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
- Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).
