نهج موحد لتنقية مولتبيسيسيز من الثدييات خلايا الجرثومية الذكور من الأنسجة الميكانيكية التفكك والتدفق الخلوي
Summary
يصف هذا العمل توحيد طريقة للحصول على السكان الخلايا الجرثومية المنقى من الأنسجة الخصية من أنواع الثدييات المختلفة. وهو بروتوكول مباشر يجمع بين التفكك الخصية الميكانيكية، تلطيخ مع هويشت-33342 و يوديد بروبيديوم، و فاكس فرز، مع تطبيقات واسعة في الدراسات المقارنة للبيولوجيا التناسلية للذكور.
Abstract
كان الفلورسنت تنشيط الخلايا الفرز (فاكس) واحدة من الطرق المفضلة لعزل السكان المخصب من الخلايا الجرثومية الخصية الثدييات. حاليا، فإنه يسمح للتمييز ما يصل إلى 9 الفئران السكان الخلايا الجرثومية مع ارتفاع الغلة والنقاء. هذا عالية الدقة في التمييز والتنقية ممكنة بسبب التغيرات الفريدة في هيكل الكروماتين وكمية طوال الحيوانات المنوية. ويمكن التقاط هذه الأنماط عن طريق التدفق الخلوي للخلايا الجرثومية الذكور ملطخة الأصباغ الحمض النووي ملزم الفلورسنت مثل هويشت-33342 (هويشت). هنا هو وصف مفصل للبروتوكول وضعت مؤخرا لعزل الخلايا الجرثومية الخصية الثدييات. باختصار، يتم إنشاء تعليق خلية واحدة من الأنسجة الخصية عن طريق التفكك الميكانيكية، ملطخة مزدوجة مع هويشت و يوديد بروبيديوم (بي) ومعالجتها عن طريق التدفق الخلوي. استراتيجية التسلسلي التسلسلي، بما في ذلك اختيار الخلايا الحية (بي سلبية) مع محتوى الحمض النووي مختلفة (كثافة هويشت)، طs المستخدمة خلال فرز فاكس لتمييز ما يصل إلى 5 أنواع الخلايا الجرثومية. وتشمل هذه الحالات، مع متوسط النقاء المقابلة (يحددها الفحص المجهري): سبيرماتوغونيا (66٪)، الابتدائي (71٪) والثانوية (85٪) الحيوانات المنوية، والحيوانات المنوية (90٪)، فصل أكثر إلى جولة (93٪) واستطالة (87٪). تنفيذ سير العمل بأكمله هو واضح، ويسمح لعزل 4 أنواع الخلايا في وقت واحد مع الجهاز فاكس المناسبة، ويمكن أن يؤديها في أقل من 2 ساعة. كما خفض وقت المعالجة أمر بالغ الأهمية للحفاظ على علم وظائف الأعضاء من خلايا الجسم الحي السابقين ، وهذه الطريقة مثالية للدراسات المصب عالية الإنتاجية من الذكور البيولوجيا الخلية الجرثومية. وعلاوة على ذلك، بروتوكول موحد لتنقية متعددة الطبقات من الخلايا الجرثومية الثدييات يلغي المصادر المنهجية للمتغيرات ويسمح لمجموعة واحدة من الكواشف لاستخدامها لنماذج حيوانية مختلفة.
Introduction
ونظرا لعدم وجود نظام في المختبر ممثل تطور الحيوانات المنوية، وجود عدم التجانس الخلوية كبيرة في خصية، دراسات بيولوجيا الخلية الجرثومية الذكور تتطلب تقنيات قوية لعزل السكان المخصب من أنواع الخلايا المحددة. وقد استخدمت على نطاق واسع الفرز خلية مضان (فاكس) لهذا الغرض 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، كما أنه يوفر عالية الغلة والنقاء، ويفوق أساليب العزلة الأخرى في عدد أنواع الخلايا الجرثومية التي يمكن التعرف عليها و حدد 6 ، 7 ، 8 . ويستند مبدأ تحليل التدفق الخلوي على الكشف عن أنماط ضوء التفاضلية التالية شعاع الليزر الإثارة من خلايا واحدة. كما يمر خلية من خلال الليزر فإنه يعكس / ينثر الضوءفي جميع الزوايا، يتناسب مع حجم الخلية (مبعثر إلى الأمام؛ فسك) وإلى تعقيد الخلايا (الجانب مبعثر؛ سك). انظر أورميرود 9 للحصول على معلومات مفصلة عن التدفق الخلوي.
والخلايا الجرثومية الذكور تخضع تعديلات محددة في محتوى الحمض النووي، هيكل الكروماتين، وحجم وشكل في جميع مراحل مختلفة من الحيوانات المنوية. وهكذا، يمكن تحديد السكان خلية متميزة وفصلها عن طريق الجمع بين تشتت الضوء وتلطيخ الحمض النووي مع الأصباغ الفلورية 10 ، 11 . العديد من الأصباغ يمكن استخدامها لهذا الغرض (استعرض في جيسينجر و رودريجيز كاسورياغا 3 )، مثل هويشست-33342 (هويشست) التي كثيرا ما تستخدم في تحليل التدفق الخلوي للخلايا الخصية للعقد الماضي 1 ، 2 ، 4 ، 10 ، 12 . UPOن الإثارة مع الأشعة فوق البنفسجية ضوء، هويشت تنبعث مضان الأزرق يتناسب مع محتوى الحمض النووي الخلوي في حين يعكس مضان أحمر بعيدة التباين في هيكل الكروماتين والضغط 1 ، 13 ، 14 . ونتيجة لذلك، الخلايا الجرثومية الذكور في مراحل مختلفة من التمايز تظهر أنماط محددة خلال فاكس من هويست الملون تعليق خلية واحدة (هو-فاكس، 1 ، 12 ). ومن المثير للاهتمام، ويرجع ذلك إلى آلية إفلوكس صبغ التي هي نشطة فقط خلال مرحلة سبيرماتوغونيال، شدة هويشت مضان الأزرق لا يتناسب مع محتوى الكروماتين في هذه الخلايا، وأنها تجمع كجانب جانب خلال هو-فاكس 15 . بالإضافة إلى ذلك، الجمع بين تلطيخ هويشست مع يوديد بروبيديوم يبيدي صبغ (بي) يسمح للمستخدمين للتمييز الحية (بي سلبية) من الخلايا الميتة (بي إيجابية) خلال فاكس 1 <سوب>، 2 ، 10 ، 12 . وقد استخدمت هذه الاستراتيجية سابقا في تحليلات سايتوميتريك تدفق الخلايا الجرثومية الخصية والأمثل على نطاق واسع في الماوس لتمييز ما يصل إلى 9 أنواع الخلايا الجرثومية، بما في ذلك الخلايا في 4 مراحل مختلفة من الانقسام الاختزالي I 1 ، 2 ، 4 ، 16 . لغرض هذا العمل، تلطيخ هويشت ثلاث مزايا رئيسية. أولا، تم تطبيق هو-فاكس بنجاح لعزل الخلايا الجرثومية الذكور في نموذج الماوس 1 ، 2 ، 12 ، والقوارض الأخرى مثل الفئران وخنزير غينيا 17 ، 18 ، 19 . ثانيا، هوشست هو صبغ خلية متخلل ولا يتطلب بيرمابيليزاتيون غشاء، لذلك بريزرفيس سلامة الخلية. وأخيرا، لا حاجة إلى العلاج ريبونوكلياز منذ ربط هويشت تفضيلي لتسلسل الحمض النووي بولي (د [أت]) 1 ، 20 ، مما يعني أنه يتم الحفاظ على الحمض النووي الريبي، بالإضافة إلى الحمض النووي والبروتينات، ويمكن استخدامها لمزيد من الدراسات الجزيئية المصب من الجرثومة تمايز الخلايا.
على الرغم من التشابه في الحمض النووي بلوادي و / أو ستينابيليتي لوحظ في تحليلات التدفق الخلوي من أنواع الثدييات (استعرض في جيسينجر و رودريجيز كاسورياغا 3 )، كان هناك قدر كبير من التباين في البروتوكولات الموصوفة لعزل الخلايا الجرثومية الذكور عن طريق التدفق الخلوي. وقد استخدمت دراسات مختلفة بروتوكولات محددة لتفكك الأنسجة، واستخدمت الأصباغ ملزم الحمض النووي متميزة (وحدها أو في تركيبة) واستراتيجيات فاكس التزوير في الكائنات نموذج مختلف، أساسا الماوس والفئران وخنزير غينيا. ومن ثم، فإن المقارنة المباشرة بين البيانات التي تم جمعها لمختلف الأنواع يمكن أن تتأثر بالتبغوذلك بسبب التباين بين المنهجيات. الأهم من ذلك، فإن حفظ مذهل للديناميات لونين في جميع أنحاء الحيوانات المنوية الثدييات (2N-4N-2N-1N) يشير إلى أن بروتوكول موحد يمكن تطبيقها بشكل عرضي على مجموعة متنوعة من أنواع الثدييات.
وكان الهدف من هذه الدراسة لتطوير سير عمل واحد ينطبق على أنواع الثدييات المختلفة، من خلال الجمع بين وتكييف التقنيات المنشورة سابقا 2 ، 20 . تم تحقيق توحيد طريقة لمعالجة الأنسجة من خلال أداء التفكك الميكانيكية للتغلب على الحاجة إلى تعديلات محددة الأنواع المطلوبة للهضم الأنزيمي 5 . ومن الجدير بالذكر أن تفكك الميكانيكية من الأنسجة القوارض الخصية وقد ثبت أن أداء أفضل من الأنزيمية الهضم الأنسجة 20 و هو-فاكس من تعليق خلية واحدة الناتجة عن كل من الطرق المعرضنتائج مماثلة 5 . كدليل على المبدأ، يصف هذا البروتوكول الإعدادات المستخدمة لعزل ما يصل إلى 5 السكان الخلية الجرثومية: سبيرماتوغونيا (سبغ). (سيك I)، والحيوانات المنوية الثانوية (سيك إي)، والحيوانات المنوية (سبد) – جولة (رسبد) واستطالة (إسبد). الأهم من ذلك، فمن السهل أن تنفذ في المختبر، مع المتطلبات الرئيسية يجري نظام تفكك الأنسجة والوصول إلى فارز الخلية مجهزة ليزر الأشعة فوق البنفسجية. هذا سير العمل ( الشكل 1 ) سريع ومباشر ويسمح العزلة في وقت واحد من 4 السكان الخلايا الجرثومية من الأنسجة الخصية الطازجة في أقل من 2 ساعة. ويعد وقت المعالجة المخفض أمرا حاسما للحفاظ على سلامة الخلوية لمزيد من الإجراءات النهائية. وعلاوة على ذلك، فإن أدائها الناجح في 5 أنواع مختلفة تشير إلى أنه يمكن تطبيقها على نطاق واسع داخل كليد الثدييات، مما يجعلها الطريقة المثلى لعزل الخلايا الجرثومية لدراسات مقارنة من الثدييات التناسلية للذكور الثديياتفوتوني؛.
ويتكون هذا البروتوكول من ثلاثة أقسام رئيسية، وبصرف النظر عن الخطوات التحضيرية: (1) التفكك الميكانيكي للأنسجة الخصية و (2) تلطيخ الخلايا الخصية مع هويشت و بي، تليها (3) فاكس فرز الخلايا المنوية ذات الصلة. مرة واحدة التي تم جمعها، وهذه المجموعات المخصبة من مختلف الخلايا الجرثومية الخصية الثدييات يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من التطبيقات. يصف هذا البروتوكول "واحد الحجم يناسب الجميع" طريقة التفكك لتنقية الخلايا الجرثومية الذكور من العديد من أنواع الثدييات المختلفة. اعتمادا على نوع من مستخدمي الدراسة ترغب في إجراء مع الخلايا الجرثومية المعزولة، وسائل الإعلام الأخرى أو المخازن المؤقتة يمكن استخدامها. الخطوات بروتوكول التالية هي لتوليد تعليق خلية واحدة من الخصية الفئران كله.
Protocol
Representative Results
Discussion
وبالنظر إلى ديناميات لونين المحفوظة للغاية أثناء الحيوانات المنوية في الثدييات، وكان الهدف من هذا العمل لتطوير بروتوكول لعزل الخلايا الجرثومية الذكور في مراحل متميزة من التمايز من الأنسجة الخصية مختلفة الثدييات ( الشكل 1 ). واحدة من العقبات الرئيسية…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلفين أشكر مستشفى هيلسايد الحيوان (سانت لويس، مو) لكلب الخصيتين. جيسون أراند ومختبر الدكتور تيد سيسرو في جامعة واشنطن في سانت لويس (واشو) لتوفير الخصيتين الفئران و بريان تابيرس للمساعدة في جمع؛ جاريد هارتسوك ومختبر الدكتور سالت في واشو للخصيتين خنزير غينيا. والدكتور مايكل تالكوت في قسم الطب المقارن في واشو لخياطة الخصية المصغرة. كما يعترف المؤلفون بمركز ألفين جيه سيتمان للسرطان في كلية الطب بجامعة واشنطن ومستشفى بارنز اليهودي في سانت لويس، مو، لاستخدام جهاز سيتمان فلو سايتوميتري كور الذي يوفر خدمة فرز الخلايا التي يديرها الموظفون. يتم دعم مركز السرطان سيتمان في جزء من نسي دعم مركز السرطان منحة # P30 CA91842.
وقد تم تمويل هذا البحث من قبل زمالة دكتوراه فكت [سفر / بد / 51695/2011 إلى أكل]، ومنح من الولايات المتحدة المعاهد الوطنية للصحة [R01HD078641 و R01MH101810 إلى Dفك] وعقد بحثي [فك / 01262/2014 إلى مكافحة غسل الأموال].
Materials
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS ceollction |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
- Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A., Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
- Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
- Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
- Lassalle, B., et al. ‘Side Population’ cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
- Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
- Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
- Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
- Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).
