Une approche standardisée pour la purification multispécifique des cellules germinales masculines de mammifères par dissociation mécanique des tissus et cytométrie de flux

Compte tenu de l'absence d'un système in vitro représentatif de la progression de la spermatogenèse et de la présence d'une grande hétérogénéité cellulaire chez les testicules, les études sur la biologie des cellules germinales masculines nécessitent des techniques robustes pour isoler les populations enrichies de types de cellules spécifiques. Le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) a été largement utilisé à cet effet ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5} , car il fournit un rendement et une pureté élevés et surpasse d'autres méthodes d'isolement dans le nombre de types de cellules germinales qu'il peut identifier et Sélectionnez ^{6 , 7 , 8} . Le principe de l'analyse par cytométrie de flux est basé sur la détection de modèles de lumière différentielle suite à l'excitation du faisceau laser de cellules individuelles. À mesure que la cellule passe à travers le laser, elle reflète / diffuse la lumièreÀ tous les angles, proportionnel à la taille de la cellule (diffusion vers l'avant, FSC) et à la complexité intracellulaire (scatter latéral, SSC). Voir Ormerod ⁹ pour des informations détaillées sur la cytométrie en flux.

Les cellules germinales mâles subissent des modifications spécifiques de la teneur en ADN, la structure de la chromatine, la taille et la forme dans différents stades de la spermatogenèse. Ainsi, des populations de cellules distinctes peuvent être identifiées et séparées en combinant la diffusion de la lumière et la coloration de l'ADN avec des colorants fluorescents ^{10 , 11} . Plusieurs colorants peuvent être utilisés à cet effet (revus dans Geisinger et Rodriguez-Casuriaga ³ ), tels que Hoechst-33342 (Hoechst) qui a été fréquemment utilisé dans l'analyse par cytométrie de flux de cellules testiculaires au cours de la dernière décennie ^{1 , 2 , 4 , 10 , 12} . UpoN d'excitation avec la lumière UV, Hoechst émet une fluorescence bleue proportionnelle à la teneur en ADN cellulaire, alors que la fluorescence lointain reflète la variabilité dans la structure de la chromatine et la compaction ^{1 , 13 , 14} . En conséquence, les cellules germinales mâles dans différents stades de différenciation présentent des modèles spécifiques pendant FACS des suspensions de cellules individuelles colorées par Hoechst (Ho-FACS; ^{1 , 12} ). Fait intéressant, en raison d'un mécanisme d'efflux de colorant qui n'est actif que pendant le stade spermatogoniale, l'intensité de la fluorescence Hoechst bleu n'est pas proportionnelle à la teneur en chromatine dans ces cellules, et elles se groupent en tant que population latérale pendant Ho-FACS ¹⁵ . De plus, la combinaison de la coloration Hoechst avec l'iodure de propidium (PI) non perméable permet aux utilisateurs de discriminer en direct (PI négatif) des cellules mortes (PI positives) pendant FACS ¹ <Sup>, ^{2 , 10 , 12} . Cette stratégie a été précédemment utilisée dans les analyses cytométriques de flux de cellules germinales testiculaires et optimisée de manière approfondie dans la souris pour discriminer jusqu'à 9 types de cellules germinales, y compris les cellules dans 4 différents stades de la méiose I ^{1 , 2 , 4 , 16} . Aux fins de ce travail, la coloration Hoechst présente trois avantages principaux. Tout d'abord, Ho-FACS a été appliqué avec succès à l'isolement des cellules germinales masculines dans les modèles de souris ^{1 , 2 , 12} et d'autres rongeurs tels que le rat et le cochon d'Inde ^{17 , 18 , 19} . Deuxièmement, Hoechst est un colorant perméable aux cellules et ne nécessite pas la perméabilisation de la membrane, de sorte qu'il préserveIntégrité des cellules. Enfin, aucun traitement par RNase n'est requis puisque Hoechst se lie préférentiellement aux séquences d'ADN ^{1 , 20} (ce qui signifie que l'ARN est conservé et, en plus de l'ADN et des protéines, peut être utilisé pour d'autres études moléculaires en aval du germe différenciation cellulaire.

Malgré la similitude dans la pléoïde de l'ADN et / ou la colorabilité observée dans les analyses de cytométrie de flux d'espèces de mammifères (revues dans Geisinger et Rodriguez-Casuriaga ³ ), il existe une grande variabilité dans les protocoles décrits pour l'isolement masculin des cellules germinales par cytométrie de flux. Différentes études ont utilisé des protocoles spécifiques pour la dissociation des tissus et ont utilisé des colorants distincts liés à l'ADN (seul ou en combinaison) et des stratégies de fermeture de FACS dans différents organismes modèles, principalement la souris, le rat et le cochon d'inde. Par conséquent, la comparaison directe des données recueillies pour différentes espèces peut être affectée par le tabagismeDes artefacts techniques non issus de la variabilité entre les méthodologies. Il est important de noter que la conservation frappante de la dynamique de la chromatine dans la spermatogenèse des mammifères (2N-4N-2N-1N) suggère qu'un protocole standardisé pourrait être appliqué transversalement à une variété d'espèces de mammifères.

L'objectif de cette étude était de développer un flux de travail unique applicable à différentes espèces de mammifères, en combinant et en adaptant les techniques ^{2 , 20} précédemment publiées. La normalisation d'une méthode de traitement des tissus a été obtenue en effectuant une dissociation mécanique afin de surmonter la nécessité d'effectuer des ajustements propres aux espèces nécessaires à la digestion enzymatique ⁵ . Il est à noter que la dissociation mécanique du tissu testiculaire des rongeurs s'est révélée supérieure à la digestion enzymatique des tissus ²⁰ et Ho-FACS des suspensions de cellules individuelles générées par les deux méthodes.Des résultats comparables ⁵ . En tant que preuve de principe, ce protocole décrit les paramètres utilisés pour isoler jusqu'à 5 populations de cellules germinales: la spermatogonie (SPG); Les spermatocytes primaires (SPC I) et les spermatocytes secondaires (SPC II) et les spermatides (SPD) – round (rSPD) et allongement (eSPD). Fait important, il est facile à mettre en œuvre dans le laboratoire, les principales exigences étant le système de dissociation des tissus et l'accès à un trieur de cellules équipé d'un laser UV. Ce flux de travail ( Figure 1 ) est rapide et direct et permet l'isolement simultané de 4 populations de cellules germinales à partir de tissu testiculaire frais en moins de 2 h. Le temps de traitement réduit est essentiel pour maintenir l'intégrité cellulaire pour d'autres procédures en aval. En outre, sa performance réussie dans 5 espèces différentes suggère qu'il pourrait être largement appliqué dans le clade de mammifères, ce qui en fait la méthode idéale pour isoler les cellules germinales pour des études comparatives de mammifères masculins reproducteurs biolOgy.

Ce protocole est composé de trois sections majeures, en dehors des étapes préparatoires: (1) la dissociation mécanique du tissu testiculaire et (2) la coloration des cellules testiculaires avec Hoechst et PI, suivie par (3) le triage FACS de cellules spermatogènes pertinentes. Une fois recueillies, ces populations enrichies de différentes cellules germinales testiculaires de mammifères peuvent être utilisées pour une large gamme d'applications. Ce protocole décrit une méthode de dissociation «unique pour tous» pour purifier les cellules germinales mâles de différentes espèces de mammifères différentes. Selon le type d'étude que les utilisateurs souhaitent effectuer avec les cellules germinales isolées, d'autres supports ou tampons peuvent être utilisés. Les étapes suivantes du protocole consistent à générer des suspensions monocellulaires à partir d'un testicule murin entier.