Een gestandaardiseerde benadering voor multispecies Zuivering van zoogdierkiemcellen door middel van mechanische weefseldissociatie en flowcytometrie
Summary
Dit werk beschrijft de standaardisatie van een methode om zuivere kiemcelpopulaties te verkrijgen uit testicularweefsel van verschillende zoogdieren. Het is een eenvoudig protocol dat mechanische testis dissociatie combineert, vlekken met Hoechst-33342 en propidiumjodide, en FACS-sortering, met brede toepassingen in vergelijkende studies van mannelijke voortplantingsbiologie.
Abstract
Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is een van de methoden van keuze om verrijkte populaties van zoogdier testulaire kiemcellen te isoleren. Momenteel staat het voor de discriminatie van maximaal 9 muizenkiemcelpopulaties met een hoge opbrengst en zuiverheid. Deze hoge resolutie in discriminatie en zuivering is mogelijk door unieke veranderingen in de chromatinstructuur en de hoeveelheid door middel van spermatogenese. Deze patronen kunnen worden gevangen door stromingscytometrie van mannelijke kiemcellen die zijn gekleurd met fluorescerende DNA-bindende kleurstoffen, zoals Hoechst-33342 (Hoechst). Hierin is een gedetailleerde beschrijving van een recent ontwikkeld protocol om zoogdier testulaire kiemcellen te isoleren. Kortom, enkelvoudige cel suspensies worden gegenereerd uit testiculair weefsel door mechanische dissociatie, dubbel gekleurd met Hoechst en propidiumjodide (PI) en verwerkt door flowcytometrie. Een seriële gate strategie, inclusief de selectie van levende cellen (PI negatief) met verschillende DNA-inhoud (Hoechst intensiteit), iS gebruikt tijdens het sorteren van FACS om maximaal 5 soorten kiemcel te onderscheiden. Deze omvatten, met bijbehorende gemiddelde zuiverheden (bepaald door microscopie-evaluatie): spermatogonia (66%), primaire (71%) en secundaire (85%) spermatocyten, en spermatiden (90%), verder gescheiden in ronde (93%) en verlenging (87%) subpopulaties. Uitvoering van de gehele workflow is eenvoudig, het is mogelijk om tegelijkertijd 4 cellen te isoleren met de betreffende FACS-machine en kan binnen 2 uur uitgevoerd worden. Aangezien verminderde verwerkingstijd cruciaal is om de fysiologie van ex vivo cellen te behouden, is deze methode ideaal voor downstream high-throughput studies van mannelijke kiemcelbiologie. Bovendien elimineert een gestandaardiseerd protocol voor het zuiveren van zoogdierkiemcellen door middel van multispecies methodologische bronnen van variabelen en maakt het mogelijk om een enkele reeks reagentia te gebruiken voor verschillende diermodellen.
Introduction
Gezien het gebrek aan een in vitro systeem dat representatief is voor de progressie van spermatogenese en de aanwezigheid van grote cellulaire heterogeniteit in testis, vereist studies van mannelijke kiemcelbiologie robuuste technieken om verrijkte populaties van specifieke celsoorten te isoleren. Fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) is algemeen gebruikt voor dit doel 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , omdat het hoge opbrengst en zuiverheid levert en andere isolatiemethoden overschrijdt in het aantal soorten kiemcellen die het kan identificeren en Selecteer 6 , 7 , 8 . Het principe van flow cytometry analyse is gebaseerd op de detectie van differentiële lichtpatronen na laserstraal excitatie van enkele cellen. Als een cel door de laser gaat, weerspiegelt / verspreidt het lichtIn alle hoeken, evenredig met de celgrootte (forward scatter; FSC) en intracellulaire complexiteit (side scatter; SSC). Zie Ormerod 9 voor gedetailleerde informatie over flowcytometrie.
Mannelijke kiemcellen ondergaan specifieke modificaties in DNA-inhoud, chromatinstructuur, grootte en vorm gedurende verschillende fases van spermatogenese. Dergelijke afzonderlijke celpopulaties kunnen worden geïdentificeerd en gescheiden door het combineren van lichtverstrooiing en DNA-kleuring met fluorescerende kleurstoffen 10 , 11 . Verschillende kleurstoffen kunnen hiervoor worden gebruikt (beoordeeld in Geisinger en Rodriguez-Casuriaga 3 ), zoals Hoechst-33342 (Hoechst), die in de loop van het decennium 1 , 2 , 4 , 10 vaak gebruikt is in de flowcytometrie analyse van testiculaire cellen. , 12 . upoN excitatie met UV-licht, geeft Hoechst blauwe fluorescentie die evenredig is aan het cellulaire DNA-gehalte, terwijl de verre rode fluorescentie de variabiliteit in chromatinstructuur en verdichting 1 , 13 , 14 weerspiegelt. Als gevolg hiervan vertoont mannelijke kiemcellen in verschillende stadia van differentiatie specifieke patronen tijdens FACS van Hoechst-gekleurde enkele cel suspensies (Ho-FACS; 1 , 12 ). Interessant is dat de intensiteit van Hoechst-blauwe fluorescentie niet in verhouding staat tot het chromatinegehalte in deze cellen, doordat het een effectieve kleurstofuitvloeisel is die alleen actief is tijdens het spermatogonale stadium, en ze clusteren als zijpopulatie tijdens Ho-FACS 15 . Bovendien combineert het combineren van Hoechst-kleuring met het niet-permeante kleurstofpropidiumjodide (PI) gebruikers de mogelijkheid om live (PI-negatief) te onderscheiden van dode (PI positieve) cellen tijdens FACS 1 <Sup>, 2 , 10 , 12 . Deze strategie is eerder gebruikt in flowcytometrische analyses van testische kiemcellen en is uitgebreid geoptimaliseerd in de muis om maximaal 9 kiemcellen te onderscheiden, waaronder cellen in 4 verschillende stadia van meiose I 1 , 2 , 4 , 16 . Voor dit werk heeft Hoechst-kleuring drie voornaamste voordelen. Ten eerste is Ho-FACS succesvol toegepast op de isolatie van mannelijke kiemcellen in het muismodel 1 , 2 , 12 en andere knaagdieren zoals rat en cavia 17 , 18 , 19 . Ten tweede, Hoechst is een celdoorlatende kleurstof en vereist geen membraanpermeabilisatie, zodat het zich voordoetVes celintegriteit. Tenslotte is geen RNase-behandeling nodig, aangezien Hoechst bij voorkeur aan poly (d [AT]) DNA-sequenties 1 , 20 bindt, wat betekent dat RNA bewaard blijft en naast DNA en eiwitten kan worden gebruikt voor verdere stroomafwaartse moleculaire studies van kiem Celdifferentiatie.
Ondanks de gelijkenis in DNA-ploïdie en / of vlekkelijkheid waargenomen in flowcytometrie-analyses van zoogdiersoorten (beoordeeld in Geisinger en Rodriguez-Casuriaga 3 ), is er een grote mate van variabiliteit in de protocollen beschreven voor mannelijke kiemcelisolatie door flowcytometrie. Verschillende studies hebben specifieke protocols toegepast voor weefseldissociatie, en gebruikten afzonderlijke DNA-bindende kleurstoffen (alleen of in combinatie) en FACS-gatingstrategieën in verschillende modelorganismen, vooral de muis, de rat en de cavia. Bijgevolg kan directe vergelijking van gegevens verzameld voor verschillende soorten worden beïnvloed door unaccoUnted technische artefacten die voortvloeien uit variabiliteit tussen methodologieën. Belangrijk is dat het opvallende behoud van chromatin dynamiek door middel van zoogdierspermatogenese (2N-4N-2N-1N) suggereert dat een gestandaardiseerd protocol transversaal toegepast kan worden op een verscheidenheid aan zoogdieren.
Het doel van deze studie was het ontwikkelen van een enkele workflow die van toepassing is op verschillende zoogdieren, door het combineren en aanpassen van eerder gepubliceerde technieken 2 , 20 . Standaardisatie van een werkwijze voor weefselverwerking werd bereikt door mechanische dissociatie te verrichten om de behoefte aan speciesspecifieke aanpassingen die nodig zijn voor enzymatische vertering 5 te overwinnen. Het is opmerkelijk dat mechanische dissociatie van knaagdiertesticulaire weefsels is aangetoond dat ze beter presteren dan enzymatisch weefselvertering 20 en Ho-FACS van enkelcelsuspensies die worden gegenereerd door beide methodenHet vergelijkbare resultaat 5 . Als principieel bewijs beschrijft dit protocol de instellingen die worden gebruikt om tot 5 kiemcelpopulaties te isoleren: spermatogonia (SPG); Primaire (SPC I) en secundaire spermatocyten (SPC II) en spermatiden (SPD) – ronde (rSPD) en verlenging (eSPD). Belangrijk is dat het gemakkelijk in het laboratorium kan worden geïmplementeerd, waarbij de belangrijkste vereisten het systeem zijn voor weefseldissociatie en toegang tot een celsoort uitgerust met een UV-laser. Deze workflow ( Figuur 1 ) is snel en eenvoudig en maakt het mogelijk dat 4 kiemcellenpopulaties tegelijkertijd uit vers testikelweefsel in minder dan 2 uur worden verwijderd. De verminderde verwerkingstijd is van cruciaal belang om de cellulaire integriteit te behouden voor verdere downstream procedures. Bovendien suggereert de succesvolle prestatie in 5 verschillende soorten dat het in het zoogdierklauw in grote mate kan worden toegepast, waardoor het de ideale methode is om kiemcellen te isoleren voor vergelijkende studies van zoogdieren mannelijke voortplantingsbiolgie.
Dit protocol bestaat uit drie hoofdafdelingen, afgezien van voorbereidende stappen: (1) de mechanische dissociatie van testicularweefsel en (2) kleuring van testiculaire cellen met Hoechst en PI, gevolgd door (3) FACS-sortering van relevante spermatogene cellen. Eenmaal verzameld, kunnen deze verrijkte bevolkingen van verschillende zoogdier testulaire kiemcellen gebruikt worden voor een breed scala aan toepassingen. Dit protocol beschrijft een dissociatiemethode met een grootte van één maat, om mannelijke kiemcellen van veel verschillende zoogdieren te zuiveren. Afhankelijk van het type studie dat gebruikers met de geïsoleerde kiemcellen willen uitvoeren, kunnen andere media of buffers worden gebruikt. De volgende protocol stappen zijn voor het opwekken van enkel-cel suspensies van één hele murine testis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gezien de sterk geconserveerde chromatin dynamiek tijdens spermatogenese bij zoogdieren, was het doel van dit werk een protocol te ontwikkelen om mannelijke kiemcellen in afzonderlijke stadia van differentiatie van verschillende zoogdier testulaire weefsels te isoleren ( Figuur 1 ). Een van de belangrijkste obstakels bij het toepassen van een enkele workflow op verschillende diermodellen is de behoefte aan soortspecifieke aanpassingen, met name wat betreft weefseldissociatieprotocollen. Hui…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken het Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) voor hondentestes; Jason Arand en Dr. Ted Cicero's lab aan de Washington University in St. Louis (WashU) voor het leveren van rat testes en Brianne Tabers voor het assisteren van de collectie; Jared Hartsock en Dr. Salt's Lab bij WashU voor de proefkonijnen; En Dr. Michael Talcott bij de afdeling Comparatieve Geneeskunde bij WashU voor de miniatuur varkens testis. De auteurs erkennen ook het Alvin J. Siteman Cancer Center aan de Washington University School of Medicine en Barnes-Jewish Hospital in St. Louis, MO, voor het gebruik van de Siteman Flow Cytometry Core, die een door de personeelsleden georganiseerde celsorteringsdienst leverde. Het Siteman Cancer Center wordt gedeeltelijk ondersteund door NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842.
Dit onderzoek werd gefinancierd door een FCT-doctorale gemeenschap [SFRH / BD / 51695/2011 naar ACL], subsidies van de Verenigde Staten National Institutes of Health [R01HD078641 en R01MH101810 naar DFC] en een FCT onderzoeksovereenkomst [IF / 01262/2014 naar AML].
Materials
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS ceollction |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
References
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A. Flow cytometry of murine spermatocytes. Curr Protoc Cytom. 72, (2015).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in Mammalian spermatogenesis. Cytogenet Genome Res. 128 (1-3), 46-56 (2010).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lima, A. C., et al. Multispecies Purification of Testicular Germ Cells. Biol Reprod. , (2016).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. J Vis Exp. (80), (2013).
- Chang, Y. F., Lee-Chang, J. S., Panneerdoss, S., MacLean, J. A., Rao, M. K. Isolation of Sertoli, Leydig, and spermatogenic cells from the mouse testis. Biotechniques. 51 (5), (2011).
- Margolin, G., Khil, P. P., Kim, J., Bellani, M. A., Camerini-Otero, R. D. Integrated transcriptome analysis of mouse spermatogenesis. BMC Genomics. 15, 39 (2014).
- Grogan, W. M., Farnham, W. F., Sabau, J. M. DNA analysis and sorting of viable mouse testis cells. J Histochem Cytochem. 29 (6), 738-746 (1981).
- Mays-Hoopes, L. L., Bolen, J., Riggs, A. D., Singer-Sam, J. Preparation of spermatogonia, spermatocytes, and round spermatids for analysis of gene expression using fluorescence-activated cell sorting. Biol Reprod. 53 (5), 1003-1011 (1995).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Watson, J. V., Nakeff, A., Chambers, S. H., Smith, P. J. Flow cytometric fluorescence emission spectrum analysis of Hoechst-33342-stained DNA in chicken thymocytes. Cytometry. 6 (4), 310-315 (1985).
- Lassalle, B., et al. ‘Side Population’ cells in adult mouse testis express Bcrp1 gene and are enriched in spermatogonia and germinal stem cells. Development. 131 (2), 479-487 (2004).
- Omran, H. M., Bakhiet, M., Dashti, M. G. DNA integrity is a critical molecular indicator for the assessment of male infertility. Mol Med Rep. 7 (5), 1631-1635 (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santinaque, F., Lopez-Carro, B., Geisinger, A. Simple and efficient technique for the preparation of testicular cell suspensions. J Vis Exp. (78), (2013).
- Rodriguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santinaque, F. F., Lopez-Carro, B., Folle, G. A. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79 (8), 625-634 (2011).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol Proced Online. 11, 184-195 (2009).
- Hess, R. A., Renato de Franca, L. Spermatogenesis and cycle of the seminiferous epithelium. Adv Exp Med Biol. 636, 1-15 (2008).
- Zhao, H., Traganos, F., Dobrucki, J., Wlodkowic, D., Darzynkiewicz, Z. Induction of DNA damage response by the supravital probes of nucleic acids. Cytometry A. 75 (6), 510-519 (2009).
- Gassei, K., Ehmcke, J., Dhir, R., Schlatt, S. Magnetic activated cell sorting allows isolation of spermatogonia from adult primate testes and reveals distinct GFRa1-positive subpopulations in men. J Med Primatol. 39 (2), 83-91 (2010).
- Hayama, T., et al. Practical selection methods for rat and mouse round spermatids without DNA staining by flow cytometric cell sorting. Mol Reprod Dev. 83 (6), 488-496 (2016).
- Zhu, L., et al. FACS selection of valuable mutant mouse round spermatids and strain rescue via round spermatid injection. Zygote. 23 (3), 336-341 (2015).
