Un approccio standardizzato per la depurazione multispecie di cellule germinali maschili di mammiferi mediante dissociazione tissutale meccanica e citometria del flusso
Summary
Questo lavoro descrive la standardizzazione di un metodo per ottenere le popolazioni di cellule germinali purificate dal tessuto testicolo di diverse specie di mammiferi. È un protocollo diretto che combina la dissociazione meccanica dei testicoli, la colorazione con Hoechst-33342 e il ioduro di propidium e l'ordinamento FACS, con ampie applicazioni in studi comparativi della biologia riproduttiva maschile.
Abstract
La classificazione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) è stata uno dei metodi di scelta per isolare popolazioni arricchite di cellule germinali testicolari mammiferi. Attualmente permette di discriminare fino a 9 popolazioni di cellule germinali ad alto rendimento e purezza. Questa alta risoluzione in discriminazione e purificazione è possibile grazie a cambiamenti unici nella struttura e quantità di cromatina durante la spermatogenesi. Questi schemi possono essere catturati mediante citometria a flusso di cellule germinali maschiate colorate fluorescenti di DNA come Hoechst-33342 (Hoechst). Ecco una descrizione dettagliata di un protocollo recentemente sviluppato per isolare cellule germinali testicolari mammiferi. In breve, sospensioni singole cellule sono generate dal tessuto testicolo mediante dissociazione meccanica, doppiate con Hoechst e ioduro di propidium (PI) e trattate mediante citometria a flusso. Una strategia di gateway seriale, compresa la selezione di cellule vive (PI negative) con diverso contenuto di DNA (intensità di Hoechst), iS utilizzato durante l'ordinamento FACS per discriminare fino a 5 tipi di cellule germinali. Queste includono, con corrispondenti purezza medie (determinate dalla valutazione microscopica): spermatogoni (66%), spermatosi primari (71%) e secondari (85%) e spermatidi (90%), ulteriormente separati in tondo (93%) e allungamento (87%) delle sottopopolazioni. L'esecuzione dell'intero flusso di lavoro è semplice, consente l'isolamento di 4 tipi di celle contemporaneamente con la macchina FACS appropriata e può essere eseguita in meno di 2 ore. Poiché il tempo di lavorazione ridotto è fondamentale per preservare la fisiologia delle cellule ex vivo , questo metodo è ideale per gli studi ad alta produttività a valle della biologia delle cellule germinali maschili. Inoltre, un protocollo standardizzato per la depurazione multispecie di cellule germinali dei mammiferi elimina le fonti metodologiche di variabili e consente un singolo insieme di reagenti da utilizzare per diversi modelli animali.
Introduction
Data la mancanza di un sistema in vitro rappresentativo della progressione della spermatogenesi e la presenza di una grande eterogeneità cellulare nei testicoli, gli studi sulla biologia delle cellule germinali maschili richiedono tecniche robuste per isolare popolazioni arricchite di specifici tipi di cellule. La classificazione delle cellule attivata con fluorescenza (FACS) è stata ampiamente utilizzata per questo scopo 1 , 2 , 3 , 4 , 5 in quanto fornisce elevata resa e purezza e supera altri metodi di isolamento nel numero di cellule germinali che può identificare e Selezionare 6 , 7 , 8 . Il principio dell'analisi della citometria a flusso si basa sulla rilevazione di modelli di luce differenziale a seguito di eccitazione laser di fascio singolo. Quando una cellula passa attraverso il laser, riflette / scattere la luceA tutti gli angoli, proporzionali alla dimensione cellulare (forward scatter, FSC) e alla complessità intracellulare (side scatter; SSC). Vedere Ormerod 9 per informazioni dettagliate sulla citometria a flusso.
Le cellule germinali maschili subiscono modifiche specifiche nel contenuto del DNA, nella struttura cromatica, nella dimensione e nella forma in diverse fasi della spermatogenesi. Così, le popolazioni cellulari distinte possono essere identificate e separate separando la dispersione luminosa e la colorazione del DNA con coloranti fluorescenti 10 , 11 . Per questo scopo possono essere impiegati diversi coloranti (esaminati in Geisinger e Rodriguez-Casuriaga 3 ), come Hoechst-33342 (Hoechst), che è stato usato frequentemente nell'analisi di flusso cytometry delle cellule testicolari nell'ultimo decennio 1 , 2 , 4 , 10 , 12 . UpoN eccitazione con luce UV, Hoechst emette una fluorescenza blu proporzionale al contenuto cellulare del DNA, mentre la fluorescenza molto lunga rispecchia la variabilità nella struttura cromatica e nella compattazione 1 , 13 , 14 . Di conseguenza, le cellule germinali maschili in differenti fasi di differenziazione mostrano modelli specifici durante la FACS di Hoechst-sospese singole cellule (Ho-FACS; 1 , 12 ). È interessante notare che, a causa di un meccanismo di efflusso di tinture che è attivo solo durante lo stadio spermatogoniale, l'intensità della fluorescenza blu di Hoechst non è proporzionale al contenuto di cromatina in queste cellule e si aggrappa come popolazione laterale durante la Ho-FACS 15 . Inoltre, combinando la colorazione Hoechst con il non-permeante propidio ioduro (PI) permette agli utenti di discriminare in tempo reale (PI negativo) da cellule morte (PI positive) durante FACS 1 <Sup>, 2 , 10 , 12 . Questa strategia è stata precedentemente utilizzata per analisi citometriche a flusso di cellule germinali testiche e ottimizzata in maniera estesa nel topo per discriminare fino a 9 tipi di cellule germinali, comprese le cellule in 4 diverse fasi della meiosi I 1 , 2 , 4 , 16 . Ai fini di questo lavoro, la colorazione Hoechst ha tre vantaggi principali. In primo luogo, Ho-FACS è stato applicato con successo all'isolamento di cellule germinali maschili nel modello del topo 1 , 2 , 12 e altri roditori come ratto e cavia 17 , 18 , 19 . In secondo luogo, Hoechst è un colorante permeante per cellule e non richiede permeabilizzazione della membrana, perciò prende in considerazioneIntegrità delle cellule ves. Infine, non è richiesto alcun trattamento di RNase in quanto Hoechst si lega preferibilmente alle sequenze 1 , 20 di poli (d [AT]), il che significa che l'RNA è conservato e, oltre al DNA e alle proteine, può essere utilizzato per ulteriori studi molecolari a valle di germi Differenziazione delle cellule.
Nonostante la somiglianza nella ploidia e / o nella tangibilità del DNA osservata nelle analisi di flusso cytometry delle specie di mammiferi (riesaminata in Geisinger e Rodriguez-Casuriaga 3 ), vi è stata una buona variabilità nei protocolli descritti per l'isolamento delle cellule germinali maschili mediante citometria a flusso. Diversi studi hanno impiegato protocolli specifici per la dissociazione dei tessuti e hanno utilizzato differenti coloranti legati al DNA (da soli o in combinazione) e strategie di gocciolamento FACS in diversi organismi del modello, principalmente il topo, il ratto e la cavia. Di conseguenza, il confronto diretto dei dati raccolti per diverse specie può essere influenzato da unaccoManufatti tecnici non determinati derivanti dalla variabilità tra le metodologie. Importante, la notevole conservazione delle dinamiche di cromatina durante la spermatogenesi dei mammiferi (2N-4N-2N-1N) suggerisce che un protocollo standardizzato possa essere trasversalmente applicato ad una varietà di specie di mammiferi.
L'obiettivo di questo studio è stato quello di sviluppare un singolo flusso di lavoro applicabile a diverse specie di mammiferi, combinando e adattando le tecniche precedentemente pubblicate 2 , 20 . La standardizzazione di un metodo per l'elaborazione dei tessuti è stata ottenuta eseguendo la dissociazione meccanica per superare la necessità di adeguamenti specifici delle specie necessari per la digestione enzimatica 5 . È degno di nota che la dissociazione meccanica del tessuto testicolare del roditore ha dimostrato di essere migliore della digestione del tessuto enzimatico 20 e Ho-FACS delle sospensioni di singole cellule generate da entrambi i metodiRisultati comparabili 5 . Come prova del principio, questo protocollo descrive le impostazioni utilizzate per isolare fino a 5 popolazioni di cellule germinali: spermatogoni (SPG); Primari (SPC I) e spermatociti secondari (SPC II) e spermatidi (SPD) – rotondi (rSPD) e allungamento (eSPD). Importante, è facile da implementare in laboratorio, con i requisiti principali che sono il sistema per la dissociazione tissutale e l'accesso a un cellulare dotato di un laser UV. Questo flusso di lavoro ( Figura 1 ) è veloce e semplice e consente l'isolamento simultaneo di 4 popolazioni di cellule germinali da tessuti testicolari freschi in meno di 2 ore. Il tempo di lavorazione ridotto è fondamentale per mantenere l'integrità cellulare per ulteriori procedure a valle. Inoltre, la sua performance di successo in 5 diverse specie suggerisce che potrebbe essere applicata ampiamente all'interno della cladi mammiferi, rendendolo il metodo ideale per isolare le cellule germinali per studi comparativi di biolo riproduttivo maschile mammiferogia.
Questo protocollo è composto da tre sezioni principali, a parte le fasi preparatorie: (1) la dissociazione meccanica del tessuto testicolo e (2) la colorazione delle cellule testicolari con Hoechst e PI, seguito da (3) ordinamento FACS di cellule spermatogeniche pertinenti. Una volta raccolte, queste popolazioni arricchite di differenti cellule germinali testicoli mammiferi possono essere utilizzate per un'ampia gamma di applicazioni. Questo protocollo descrive un metodo di dissociazione "di un solo formato" per purificare le cellule germinali maschili da molte specie di mammiferi differenti. A seconda del tipo di studio che gli utenti desiderano condurre con le cellule germinali isolate, possono essere utilizzati altri supporti o buffer. I seguenti passi del protocollo sono per generare sospensioni a cellule singole da un intero testicolo murino.
Protocol
Representative Results
Discussion
Considerando le dinamiche cromatografiche altamente conservate durante la spermatogenesi nei mammiferi, l'obiettivo di questo lavoro era quello di sviluppare un protocollo per isolare le cellule germinali maschili in differenti stadi di differenziazione dai diversi tessuti testicolari dei mammiferi ( Figura 1 ). Uno degli ostacoli principali nell'applicazione di un unico flusso di lavoro a modelli animali diversi è la necessità di adeguamenti specifici delle specie, in particolare…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il Hillside Animal Hospital (St. Louis, MO) per i testicoli del cane; Jason Arand e il laboratorio del Dott. Ted Cicero presso l'Università di Washington di St. Louis (WashU) per aver fornito i test di ratto e Brianne Tabers per assistere alla raccolta; Jared Hartsock e il laboratorio del Dr. Salt al WashU per i testicoli della cavia; E il Dott. Michael Talcott presso la Divisione di Medicina Comparativa a WashU per il testicolo di maiale in miniatura. Gli autori riconoscono inoltre il Centro di Cancer di Alvin J. Siteman presso la Scuola di Medicina di Washington e l'Ospedale Ebreo di Barnes a St. Louis, MO, per l'utilizzo del Siteman Flow Cytometry Core, che ha fornito un servizio di selezione delle cellule gestite dal personale. Il Centro Cancer Siteman è supportato in parte da NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842.
Questa ricerca è stata finanziata da una borsa di dottorato FCT [SFRH / BD / 51695/2011 a ACL], sovvenzioni degli istituti nazionali di salute degli Stati Uniti [R01HD078641 e R01MH101810 a DFC] e un contratto di ricerca FCT [IF / 01262/2014 a AML].
Materials
| 4% paraformaldehyde | VWR | #15710 | 4% PFA, For fixing sorted cells |
| Medimachine | BD Biosciences | #340588; | System for testis dissociation |
| 1X Dulbecco modified Eagle medium | Life Technologies | #31053 | DMEM, for testis dissociation |
| Medicon | BD Biosciences | #340591 | Disaggregation cartridge for testis dissociation |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | #10082139 | FBS, for FACS ceollction |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | #H3570 | Hoecsht, For FACS staining |
| 40µm cell strainer | GREINER BIO-ONE | #89508-342 | For testis dissociation |
| 100x 15mm petri dish | Falcon | #351029 | For testis dissection |
| 5mL polypropylene round-bottom tubes | Falcon | #352063 | For FACS collection |
| 1.5mL Eppendorf tubes | VWR | #20170-650 | For FACS collection |
| 3mL needless syringe | BD Biosciences | #309657 | For testis dissociation |
| 50mL conical tube | MIDSCI | #C50R | For testis dissociation |
| Propidium Iodide | Invitrogen | #L7011 | PI, For FACS staining |
| MoFlo Legacy cell sorter | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Summit Cell Sorting software | Beckman Coulter | #ML99030 | For FACS |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | #AM9625 | PBS, For microscopy |
| Microscopic glass slide | Fisher Scientific | #12-544-4 | For microscopy |
| Glass coverslip | Fisher Scientific | #12-548-87 | For microscopy |
| Disposable transfer pipette (3mL) | Samco Scientific | #225 | For testis dissociation |
| DNase I | Roche | #10104159001 | For testis dissociation |
| Carbon steel surgical blade | Miltex | #4-111 | For testis dissection |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | #C10227 | For automatic cell counting |
| Trypan blue solution (0.4%) | Sigma | #T8154 | For viability staining |
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