Summary

Análisis de supercomplexes de la cadena de transporte de electrones mitocondriales con electroforesis nativa, ensayos en gel y electroelución

Published: June 01, 2017
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Summary

Este protocolo describe la separación de complejos funcionales de cadenas de transporte de electrones mitocondriales (Cx) IV y sus supercomplejos utilizando electroforesis nativa para revelar información sobre su ensamblaje y estructura. El gel nativo puede someterse a inmunotransferencia, ensayos en gel y purificación por electroelución para caracterizar adicionalmente los complejos individuales.

Abstract

La cadena de transporte de electrones mitocondriales (ETC) transduce la energía derivada de la descomposición de varios combustibles en la moneda bioenergética de la célula, ATP. El ETC se compone de 5 complejos masivos de proteínas, que también se agrupan en supercomplejos llamados respirasomes (CI, C-III y C-IV) y synthasomes (CV) que aumentan la eficiencia del transporte de electrones y la producción de ATP. Se han utilizado varios métodos durante más de 50 años para medir la función ETC, pero estos protocolos no proporcionan información sobre el ensamblaje de complejos individuales y supercomplejos. Este protocolo describe la técnica de electroforesis en gel de gel de poliacrilamida nativa (PAGE), un método que fue modificado hace más de 20 años para estudiar la estructura compleja de ETC. La electroforesis nativa permite la separación de los complejos ETC en sus formas activas, y estos complejos pueden entonces estudiarse usando inmunotransferencia, ensayos en gel (IGA) y purificación por electroelución. Combinando el reLos resultados de PAGE PAGE nativo con los de otros ensayos mitocondriales, es posible obtener una imagen completa de la actividad ETC, su ensamblaje dinámico y desmontaje, y cómo esto regula la estructura y función mitocondrial. Este trabajo también discutirá las limitaciones de estas técnicas. En resumen, la técnica de PAGE nativo, seguida de immunoblotting, IGA y electroelución, presentada a continuación, es una poderosa manera de investigar la funcionalidad y composición de los supercomplexos mitocondriales ETC.

Introduction

La energía mitocondrial en forma de ATP no sólo es esencial para la supervivencia celular, sino también para la regulación de la muerte celular. La generación de ATP por fosforilación oxidativa requiere una cadena funcional de transporte de electrones (ETC, Cx-I a IV) y ATP sintasa mitocondrial (Cx-V). Estudios recientes han demostrado que estos grandes complejos de proteínas están organizados en supercomplejos, llamados respirasomes y synthasomes 1 , 2 . Es difícil analizar la asamblea, la dinámica y la regulación de la actividad de estos complejos y supercomplejos masivos. Mientras que las mediciones del consumo de oxígeno tomadas con un electrodo de oxígeno y los ensayos enzimáticos llevados a cabo utilizando un espectrofotómetro pueden proporcionar información valiosa sobre la actividad compleja de ETC, estos ensayos no pueden proporcionar información con respecto a la presencia, tamaño y composición de subunidades del complejo proteico o supercomplejos implicados. Sin embargo, el desarrollo de azul y claro nativo (BN y CN, respectivamente) PAGE 3 ha creado una potente herramienta para revelar información importante sobre la composición compleja y el montaje / desmontaje y sobre la regulación dinámica de la organización supramolecular de estos complejos respiratorios vitales en condiciones fisiológicas y patológicas 4 .

El montaje de estos complejos en supercomplejos de orden superior parece regular la estructura y función mitocondrial 5 . Por ejemplo, el montaje respirasome aumenta la eficiencia de la transferencia de electrones y la generación de la fuerza motriz del protón a través de la membrana interna mitocondrial 5 . Además, el montaje de los sintomas no sólo aumenta la eficiencia de la producción de ATP y la transferencia de equivalentes de energía al citoplasma 2 , sino que también moldea la membrana interna mitocondrial en las crestas tubulares 6 ,/ Sup> 7 . Estudios de montaje supercompleto durante el desarrollo cardíaco en embriones de ratón muestran que la generación de Cx-I que contienen supercomplejos en el corazón comienza en alrededor del día embrionario 13,5 8 . Otros han demostrado que la cantidad de supercomplexos que contienen Cx-I disminuye en el corazón debido al envejecimiento o lesiones por isquemia / reperfusión 9 , 10 o pueden jugar un papel en la progresión de enfermedades neurodegenerativas 11 .

Este protocolo describe métodos para gel PAGE nativo que puede usarse para investigar el montaje y la actividad de los complejos ETC y supercomplejos. El peso molecular aproximado de los supercomplejos mitocondriales puede evaluarse separando los complejos proteicos en geles de poliacrilamida CN o BN. CN PAGE también permite la visualización de la actividad enzimática de todos los complejos mitocondriales directamente en el gel (ensayos en gel;IGA) 12 . Este trabajo demuestra la actividad de respirasomes resaltando la capacidad de Cx-I para oxidar NADH a través de IGA y la presencia de synthasomes debido a la actividad de hidrolización de ATP de Cx-V por IGA. Los múltiples complejos y supercomplejos que contienen Cx-I y Cx-V también pueden demostrarse transfiriendo las proteínas sobre membranas de nitrocelulosa y realizando inmunotransferencia. La ventaja de este enfoque es que BN o CN PAGE generalmente separa complejos proteicos basados ​​en su tamaño fisiológico y composición; La transferencia a una membrana conserva este patrón de bandas. Análisis de complejos de proteínas en un BN o CN PAGE también se puede hacer utilizando 2D-PAGE (véase Fiala et al 13 para una demostración) o por centrifugación de densidad de sacarosa [ 14 , 15] . Para analizar más a fondo una banda específica, puede ser extirpada de la BN PAGE, y las proteínas de este complejo de proteínas pueden ser purificadasD electroelutándolos bajo condiciones nativas. La electroelución nativa puede realizarse en pocas horas, lo que podría hacer una diferencia significativa en la difusión pasiva (tal como se utiliza en la Referencia 16) de proteínas desde un gel al tampón circundante.

En resumen, estos métodos describen varios enfoques que permiten la caracterización adicional de los supercomplexos de alto peso molecular de las membranas mitocondriales.

Protocol

Todos los experimentos se realizaron utilizando corazones de ratones C57BL / 6N (tipo salvaje). Los ratones fueron anestesiados con CO 2 antes de la dislocación cervical, y todos los procedimientos se realizaron en estricta conformidad con la División de Laboratorio de Medicina Animal en la Universidad de Rochester y en cumplimiento con la ley estatal, estatuto federal y NIH política. El protocolo fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Rochester (Comité…

Representative Results

Para visualizar supercomplexos mitocondriales, se utilizaron mitocondrias recién aisladas de ratones 17 , 18 . Los supercomplejos mitocondriales son sensibles a ciclos repetidos de congelación y descongelación, lo que conduce a su desintegración, aunque esto puede ser tolerable para algunos investigadores. Si la congelación es necesaria para el almacenamiento, para asegurar mejores resultados, las muestras no deben someterse…

Discussion

Un ETC funcional es necesario para la generación de ATP mitocondrial. Los complejos del ETC son capaces de formar dos tipos de supercomplejos: los respirasomes (Cx-I, -III, y -IV) 1 y los sintomas (Cx-V) 2 . El montaje de cada complejo es necesario para un ETC intacto, mientras que la organización de la ETC en supercomplexes se cree que aumentar la eficiencia global ETC [ 5 , 22] . No se conocen bien cómo se mon…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación de la American Heart Association Afiliado [12GRNT12060233] y el Centro de Investigación de Niños fuertes de la Universidad de Rochester.

Materials

Protean II mini-gel chamber Biorad 1658004 Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gel Biorad 1653189 Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15 VWR 95044-704 Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gel VWR GM-100 Pouring maxi-gel gradients
Transfer kit Biorad 1703930 Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422 Biorad 1652976 Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass plates Biorad 1653308 Short plates
Glass plates Biorad 1653312 Spacer plates
Glass plates Biorad 1651823 Inner plates
Glass plates Biorad 1651824 Outer Plates
Power supply Biorad 1645070 Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western  Thermo Scientific 32209 Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West Dura Thermo Scientific 34075 Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography film GE Health care 28906845 Documentation of Western blots
Film processor CP1000 Agfa NC0872640
Canon Power Shot 640  Canon NA Taking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood  Canon shielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 40% pre-mixed solution
Glycine Sigma G7403
SDS (sodium dodecyl sulfate) Invitrogen 15525-017
Tris-base Sigma T1503 Buffer
Tricine Sigma T0377
Sodium deoxychelate Sigma D66750 Detergent
EDTA Sigma E5134
Sucrose Sigma S9378
MOPS Sigma M1254 Buffer
Imidazole Sigma I15513 Buffer
Lauryl maltoside Sigma D4641 Detergent
Coomassie G250 Biorad 161-0406
Aminohexanoic acid Sigma O7260
Native  molecular weight kit GE Health care  17-0445-01 High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
Name Company Catalog Number Comments
NADH Sigma N4505
Nitroblue tetrazolium Sigma N6639
Tris HCL Sigma T3253
ATP   Sigma A2383
Name Company Catalog Number Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): Sigma 228621
Oligomycin Sigma O4876
Name Company Catalog Number Comments
Ponceau S Sigma P3504
anti-ATP5A Abcam ab14748 antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6 Abcam ab110244 antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC Calbiochem 529534 antibody to VDAC
ECL HRP linked antibody GE Health Care NA931V secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagent Biorad 170-6404
BSA
sodium chloride Sigma S9888
potassium chloride Sigma P9541
EGTA Sigma E3889
Name Company Catalog Number Comments
Silver staining Kit Invitrogen LC6070

References

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Cite This Article
Beutner, G., Porter Jr., G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. J. Vis. Exp. (124), e55738, doi:10.3791/55738 (2017).

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