Summary

Analyse des supercomplexes de la chaîne de transport d'électrons mitochondriaux avec électrophorèse native, essais en gel et électroélution

Published: June 01, 2017
doi:

Summary

Ce protocole décrit la séparation des complexes fonctionnels de la chaîne de transport d'électrons mitochondriaux (Cx) IV et des supercomplexes de ceux-ci en utilisant une électrophorèse native pour révéler des informations sur leur assemblage et leur structure. Le gel natif peut être soumis à un immunoblot, des essais en gel et une purification par électroélution pour caractériser davantage les complexes individuels.

Abstract

La chaîne de transport d'électrons mitochondriaux (ETC) transduit l'énergie dérivée de la décomposition de divers combustibles dans la monnaie bioénergétique de la cellule, l'ATP. L'ETC est composé de 5 complexes de protéines massives, qui s'ajoutent également aux supercomplexes appelés respirasomes (CI, C-III et C-IV) et synthasomes (CV) qui augmentent l'efficacité du transport d'électrons et de la production d'ATP. Diverses méthodes ont été utilisées depuis plus de 50 ans pour mesurer la fonction ETC, mais ces protocoles ne fournissent pas d'informations sur l'assemblage de complexes individuels et de supercomplexes. Ce protocole décrit la technique de l'électrophorèse sur gel de gel de polyacrylamide (PAGE), méthode qui a été modifiée il y a plus de 20 ans pour étudier la structure du complexe ETC. L'électrophorèse native permet la séparation des complexes ETC dans leurs formes actives, et ces complexes peuvent ensuite être étudiés à l'aide d'immunoblot, d'essais en gel (IGA) et de purification par électroélution. En combinant le reLes résultats de la PAGE de gel native avec ceux d'autres essais mitochondriaux, il est possible d'obtenir une image complète de l'activité ETC, son assemblage et démontage dynamique, et comment cela régule la structure et la fonction mitochondriales. Ce travail traitera également des limites de ces techniques. En résumé, la technique de la PAGE native, suivie de l'immunoblot, de l'IGA et de l'électroélution, présentée ci-dessous, est un moyen puissant d'étudier la fonctionnalité et la composition des supercomplexes ETC mitochondriales.

Introduction

L'énergie mitochondriale sous forme d'ATP n'est pas seulement essentielle pour la survie cellulaire, mais aussi pour la régulation de la mort cellulaire. La génération d'ATP par phosphorylation oxydante nécessite une chaîne fonctionnelle de transport d'électrons (ETC, Cx-I à IV) et une ATP synthase mitochondriale (Cx-V). Des études récentes ont montré que ces grands complexes de protéines sont organisés en supercomplexes, appelés respirasomes et synthasomes 1 , 2 . Il est difficile d'analyser l'assemblage, la dynamique et la régulation de l'activité de ces complexes et supercomplexes massifs. Alors que les mesures de consommation d'oxygène prises avec une électrode d'oxygène et des dosages enzymatiques menés à l'aide d'un spectrophotomètre peuvent donner des informations précieuses sur l'activité du complexe ETC, ces analyses ne peuvent pas fournir d'informations concernant la présence, la taille et la composition de sous-unité du complexe de protéines ou des supercomplexes impliqués. Cependant, le développement de natif bleu et clair (BN et CN, respectivement) PAGE 3 a créé un outil puissant pour révéler des informations importantes sur la composition complexe et le montage / démontage et sur la régulation dynamique de l'organisation supramoléculaire de ces complexes respiratoires vitaux dans des conditions physiologiques et pathologiques 4 .

L'assemblage de ces complexes en supercomplexes d'ordre supérieur semble réguler la structure et la fonction 5 mitochondriales. Par exemple, l'assemblage respirasome augmente l'efficacité du transfert d'électrons et la génération de la force motrice du proton à travers la membrane interne mitochondriale 5 . En outre, l'assemblage des synthasomes augmente non seulement l'efficacité de la production d'ATP et le transfert d'équivalents d'énergie dans le cytoplasme 2 , mais il forme également la membrane interne mitochondriale dans les crêtes tubulaires 6 , </ Sup> 7 . Les études d'assemblage de supercomplexes lors d'un développement cardiaque dans des embryons de souris montrent que la génération de supercomplexes contenant du Cx-I dans le cœur commence à environ le jour embryonnaire 13,5 8 . D'autres ont montré que la quantité de supercomplexes contenant du Cx-I diminue dans le cœur en raison du vieillissement ou des blessures par ischémie / reperfusion 9 , 10 ou peut jouer un rôle dans la progression des maladies neurodégénératives 11 .

Ce protocole décrit des méthodes pour le gel natif PAGE qui peuvent être utilisées pour étudier l'assemblage et l'activité des complexes ETC et des supercomplexes. Le poids moléculaire approximatif des supercomplexes mitochondriaux peut être évalué en séparant les complexes de protéines dans des gels de polyacrylamide CN ou BN. La PAGE CN permet également la visualisation de l'activité enzymatique de tous les complexes mitochondriaux directement dans le gel (dosage en gel;IGA) 12 . Ce travail démontre l'activité des respirasomes en soulignant la capacité du Cx-I à oxyder le NADH par IGA et la présence de synthasomes en raison de l'activité d'hydrolyse ATP de Cx-V par IGA. Les complexes multiples et les supercomplexes contenant Cx-I et Cx-V peuvent également être démontrés en transférant les protéines sur des membranes de nitrocellulose et en effectuant un immunoblot. L'avantage de cette approche est que BN ou CN PAGE sépare généralement les complexes de protéines en fonction de leur taille et de leur composition physiologiques; Le transfert vers une membrane préserve ce motif de bandes. L'analyse de complexes de protéines dans une PAGE BN ou CN peut également être effectuée en utilisant 2D-PAGE (voir Fiala et al 13 pour une démonstration) ou par centrifugation 14 , 15 de densité de saccharose. Pour analyser plus avant une bande spécifique, elle peut être excisée de la BN PAGE, et les protéines de ce complexe protéinique peuvent être purifiéesD en les électroelutant dans des conditions natives. L'électroélution native peut être effectuée en quelques heures, ce qui pourrait faire une différence significative pour la diffusion passive (telle qu'utilisée dans la référence 16) des protéines d'un gel dans le tampon environnant.

En résumé, ces méthodes décrivent plusieurs approches qui permettent de caractériser davantage les supercomplexes de poids moléculaire élevé des membranes mitochondriales.

Protocol

Toutes les expériences ont été effectuées en utilisant des coeurs à partir de souris C57BL / 6N (type sauvage). Les souris ont été anesthésiées avec du CO 2 avant la dislocation cervicale et toutes les procédures ont été effectuées en stricte conformité avec la Division de la médecine animale de laboratoire de l'Université de Rochester et conformément à la loi de l'État, à la loi fédérale et à la politique des NIH. Le protocole a été approuvé par le Comité institutionnel pou…

Representative Results

Pour visualiser les supercomplexes mitochondriales, des mitochondries fraîchement isolées de souris ont été utilisées 17 , 18 . Les supercomplexes mitochondriales sont sensibles aux cycles répétés de congélation et de décongélation, ce qui entraîne leur désintégration, bien que cela puisse être tolérable pour certains chercheurs. Si le gel est nécessaire pour le stockage, afin d'assurer les meilleurs résulta…

Discussion

Un ETC fonctionnel est nécessaire pour la génération d'ATP mitochondriale. Les complexes de l'ETC peuvent former deux types de supercomplexes: les respirasomes (Cx-I, -III et -IV) 1 et les synthasomes (Cx-V) 2 . L'assemblage de chaque complexe est nécessaire pour un ETC intact, alors que l'organisation de l'ETC en supercomplexes est censée augmenter l'efficacité générale ETC 5 , 22 ….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions de l'American Heart Association Founder's Affiliate [12GRNT12060233] et le Strong Children's Research Centre de l'Université de Rochester.

Materials

Protean II mini-gel chamber Biorad 1658004 Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gel Biorad 1653189 Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15 VWR 95044-704 Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gel VWR GM-100 Pouring maxi-gel gradients
Transfer kit Biorad 1703930 Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422 Biorad 1652976 Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass plates Biorad 1653308 Short plates
Glass plates Biorad 1653312 Spacer plates
Glass plates Biorad 1651823 Inner plates
Glass plates Biorad 1651824 Outer Plates
Power supply Biorad 1645070 Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western  Thermo Scientific 32209 Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West Dura Thermo Scientific 34075 Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography film GE Health care 28906845 Documentation of Western blots
Film processor CP1000 Agfa NC0872640
Canon Power Shot 640  Canon NA Taking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood  Canon shielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 40% pre-mixed solution
Glycine Sigma G7403
SDS (sodium dodecyl sulfate) Invitrogen 15525-017
Tris-base Sigma T1503 Buffer
Tricine Sigma T0377
Sodium deoxychelate Sigma D66750 Detergent
EDTA Sigma E5134
Sucrose Sigma S9378
MOPS Sigma M1254 Buffer
Imidazole Sigma I15513 Buffer
Lauryl maltoside Sigma D4641 Detergent
Coomassie G250 Biorad 161-0406
Aminohexanoic acid Sigma O7260
Native  molecular weight kit GE Health care  17-0445-01 High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
Name Company Catalog Number Comments
NADH Sigma N4505
Nitroblue tetrazolium Sigma N6639
Tris HCL Sigma T3253
ATP   Sigma A2383
Name Company Catalog Number Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): Sigma 228621
Oligomycin Sigma O4876
Name Company Catalog Number Comments
Ponceau S Sigma P3504
anti-ATP5A Abcam ab14748 antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6 Abcam ab110244 antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC Calbiochem 529534 antibody to VDAC
ECL HRP linked antibody GE Health Care NA931V secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagent Biorad 170-6404
BSA
sodium chloride Sigma S9888
potassium chloride Sigma P9541
EGTA Sigma E3889
Name Company Catalog Number Comments
Silver staining Kit Invitrogen LC6070

References

  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson’s disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

Play Video

Cite This Article
Beutner, G., Porter Jr., G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. J. Vis. Exp. (124), e55738, doi:10.3791/55738 (2017).

View Video