Analisando supercomplexos da cadeia de transporte de elétrons mitocondrial com eletroforese nativa, ensaios em gel e eletroeluição

A energia mitocondrial na forma de ATP não é apenas essencial para a sobrevivência celular, mas também para a regulação da morte celular. A geração de ATP por fosforilação oxidativa requer uma cadeia funcional de transporte de elétrons (ETC, Cx-I a IV) e ATP sintetase mitocondrial (Cx-V). Estudos recentes mostraram que esses grandes complexos de proteínas são organizados em supercomplexos, chamados respirasomes e synthasomes ^{1 , 2} . É desafiador analisar a montagem, a dinâmica e a regulação da atividade desses complexos maciços e supercomplexos. Enquanto as medições de consumo de oxigênio tomadas com um eletrodo de oxigênio e ensaios enzimáticos realizados usando um espectrofotômetro podem fornecer informações valiosas sobre a atividade do complexo ETC, esses ensaios não podem fornecer informações sobre a presença, tamanho e composição da subunidade do complexo de proteína ou supercomplexos envolvidos. No entanto, o desenvolvimento de nativos azuis e nítidos (BN e CN, respectivamente) A PAGE ³ criou uma ferramenta poderosa para revelar informações importantes sobre composição complexa e montagem / desmontagem e sobre a regulação dinâmica da organização supramolecular desses complexos respiratórios vitais em condições fisiológicas e patológicas ⁴ .

A montagem desses complexos em supercomplexos de ordem superior parece regular a estrutura mitocondrial e a função ⁵ . Por exemplo, a montagem do respirasome aumenta a eficiência da transferência de elétrons e a geração da força motora do próton através da membrana interna mitocondrial ⁵ . Além disso, a montagem de synthasomes não só aumenta a eficiência da produção de ATP e a transferência de equivalentes de energia para o citoplasma ² , mas também molda a membrana interna mitocondrial nas cristas tubulares ^{6 , <}/ Sup> ⁷ . Estudos de montagem de supercomplexos durante o desenvolvimento cardíaco em embriões de ratos mostram que a geração de supercomplexos contendo Cx-I no coração começa no dia embrionário 13,5 ⁸ . Outros mostraram que a quantidade de supercomplexos contendo Cx-I diminui no coração devido ao envelhecimento ou lesões de isquemia / reperfusão ^{9 , 10} ou pode desempenhar um papel na progressão de doenças neurodegenerativas ¹¹ .

Este protocolo descreve métodos para o PAGE gel nativo que podem ser usados ​​para investigar a montagem e a atividade dos complexos ETC e supercomplexos. O peso molecular aproximado dos supercomplexos mitocondriais pode ser avaliado separando os complexos de proteínas em géis de poliacrilamida CN ou BN. O CN PAGE também permite a visualização da atividade enzimática de todos os complexos mitocondriais diretamente no gel (ensaios em gel;IGA) ¹² . Este trabalho demonstra a atividade dos respirasomes ao destacar a capacidade do Cx-I de oxidar o NADH através do IGA e a presença de sinteticos devido à atividade de hidrolização de ATP da Cx-V pela IGA. Os múltiplos complexos e supercomplexos contendo Cx-I e Cx-V também podem ser demonstrados pela transferência das proteínas para membranas de nitrocelulose e realização de imunotransferência. A vantagem desta abordagem é que BN ou CN PAGE geralmente separam complexos de proteínas com base em seu tamanho e composição fisiológica; A transferência para uma membrana preserva esse padrão de bandas. A análise de complexos de proteína em uma BN ou CN PAGE também pode ser feita usando 2D-PAGE (ver Fiala et al. ¹³ para uma demonstração) ou por centrifugação de densidade de sacarose ^{14 , 15} . Para analisar ainda mais uma banda específica, ela pode ser excluída da BN PAGE, e as proteínas deste complexo proteico podem ser purificadasD, electroelutando-os sob condições nativas. A eletroeluição nativa pode ser realizada dentro de poucas horas, o que poderia fazer uma diferença significativa na difusão passiva (como usada na Referência 16) de proteínas de um gel para o amortecedor circundante.

Em resumo, esses métodos descrevem várias abordagens que permitem a caracterização adicional de supercomplexos de alto peso molecular de membranas mitocondriais.