Summary

Анализ суперкомплексов транспортной цепи митохондриальных электронов с собственным электрофорезом, в-гель-анализах и электроизлучения

Published: June 01, 2017
doi:

Summary

Этот протокол описывает разделение функциональных комплексов транспортной цепи митохондриальных электронов (Cx) IV и их суперкомплексов с использованием нативного электрофореза для раскрытия информации об их сборке и структуре. Нативный гель можно подвергать иммуноблоттингу, в-гель-анализе и очищать путем электроэлюции для дальнейшего характеристики отдельных комплексов.

Abstract

Транспортная цепь митохондриального электрона (ETC) трансдуцирует энергию, полученную в результате пробоя различных видов топлива в биоэнергетическую валюту клетки, АТФ. ETC состоит из 5 массивных белковых комплексов, которые также собираются в суперкомплексы, называемые респирасомами (CI, C-III и C-IV) и synthasomes (CV), которые повышают эффективность транспорта электронов и производства ATP. В течение более 50 лет для измерения функции ETC использовались различные методы, но эти протоколы не содержат информации о сборке отдельных комплексов и суперкомплексов. В этом протоколе описывается методика электрофореза на основе полиакриламидного геля на месте (PAGE), метод, который был модифицирован более 20 лет назад для изучения структуры комплекса ETC. Нативный электрофорез позволяет разделять комплексы ETC на их активные формы, и эти комплексы затем могут быть изучены с использованием иммуноблоттинга, в-гель-анализах (IGA) и очистки путем электроэлюции. Объединив reSAGE с исходным гелем PAGE с результатами других митохондриальных анализов, можно получить полную картину активности ETC, ее динамическую сборку и разборку и как это регулирует структуру и функцию митохондрий. В этой работе также будут обсуждаться ограничения этих методов. Таким образом, техника нативного PAGE с последующим иммуноблоттингом, IGA и электролечением, представленная ниже, является мощным способом исследования функциональности и состава суперкомплексов митохондриальных ETC.

Introduction

Митохондриальная энергия в виде АТФ не только необходима для выживания клеток, но и для регуляции клеточной смерти. Генерация АТФ путем окислительного фосфорилирования требует функциональной транспортной цепи электрона (ETC, Cx-I-IV) и митохондриальной АТФ-синтазы (Cx-V). Недавние исследования показали, что эти крупные белковые комплексы организованы в суперкомплексы, называемые респирасомами и синтасомами 1 , 2 . Трудно проанализировать сборку, динамику и регулирование активности этих массивных комплексов и суперкомплексов. В то время как измерения потребления кислорода, проведенные с помощью кислородного электрода и анализа ферментов, проводимые с использованием спектрофотометра, могут дать ценную информацию о активности комплекса ETC, эти анализы не могут предоставить информацию о составе присутствия, размера и субъединицы белкового комплекса или суперкомплексов. Тем не менее, развитие синего и чистого родного (BN и CN соответственно). СТРАНИЦА 3 создала мощный инструмент для выявления важной информации о сложном составе и сборе / разборке и о динамической регуляции супрамолекулярной организации этих жизненно важных респираторных комплексов в физиологических и патологических условиях.

Сборка этих комплексов в суперкомплексах высшего порядка, по-видимому, регулирует структуру и функцию митохондрий 5 . Например, респираторная сборка повышает эффективность переноса электрона и генерирование движущей силы протона через внутреннюю мембрану митохондрии 5 . Кроме того, сборка синтазомов не только повышает эффективность производства АТФ и перенос энергетических эквивалентов в цитоплазму 2 , но также формирует митохондриальную внутреннюю мембрану в трубчатые кристы 6 , </ Sup> 7 . Исследования суперкомплексной сборки во время развития сердца у эмбрионов мыши показывают, что генерация суперкомплексов Cx-I в сердце начинается примерно с эмбрионального дня 13,5 8 . Другие показали, что количество суперкомплексов, содержащих Cx-I, уменьшается в сердце из-за старения или повреждений от ишемии / реперфузии 9 , 10 или может играть роль в прогрессировании нейродегенеративных заболеваний 11 .

В этом протоколе описаны методы для основного гелевого PAGE, которые могут быть использованы для исследования сборки и активности комплексов ETC и суперкомплексов. Примерную молекулярную массу митохондриальных суперкомплексов можно оценить путем разделения белковых комплексов на полиакриламидные гели CN или BN. CN PAGE также позволяет визуализировать ферментативную активность всех митохондриальных комплексов непосредственно в геле (in-gel assays;ИГА) 12 . Эта работа демонстрирует активность респирасом, выделяя способность Cx-I окислять NADH через IGA и присутствие синтазомов из-за активности АТФ-гидролиза Cx-V с помощью IGA. Множественные комплексы и суперкомплексы, содержащие Cx-I и Cx-V, можно также продемонстрировать путем переноса белков на нитроцеллюлозные мембраны и проведения иммуноблоттинга. Преимущество этого подхода состоит в том, что BN или CN PAGE обычно разделяют белковые комплексы на основе их физиологических размеров и состава; Перенос на мембрану сохраняет эту картину полос. Анализ белковых комплексов в BN или CN PAGE также может быть осуществлен с использованием 2D-PAGE (см. Fiala и др. 13 для демонстрации) или центрифугированием плотности сахарозы 14 , 15 . Для дальнейшего анализа конкретной полосы ее можно вырезать из BN PAGE, и белки из этого белкового комплекса могут быть очищеныD путем электроэлюции их в естественных условиях. Наземная электроэлюция может быть выполнена в течение нескольких часов, что может существенно повлиять на пассивную диффузию (как используется в ссылке 16) белков из геля в окружающий буфер.

Таким образом, эти методы описывают несколько подходов, которые позволяют дополнительно характеризовать высокомолекулярные суперкомплексы из митохондриальных мембран.

Protocol

Все эксперименты проводили с использованием сердец у мышей C57BL / 6N (дикий тип). Мышей анестезировали СО 2 до дислокации шейки матки, и все процедуры выполнялись в строгом соответствии с Отделом лабораторной медицины животных в Рочестерском университете и в соответствии с государс?…

Representative Results

Для визуализации суперкомплексов митохондрий использовались свежеизолированные митохондрии у мышей 17 , 18 . Митохондриальные суперкомплексы чувствительны к повторяющимся циклам замораживания и оттаивания, что приводит к их распаду, х…

Discussion

Функциональный ETC необходим для генерации митохондриального АТФ. Комплексы ETC способны образовывать два типа суперкомплексов: респирасомы (Cx-I, -III и -IV) 1 и синтазомы (Cx-V) 2 . Сборка каждого комплекса необходима для неповрежденного ETC, в то время как считается, что ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана грантами от Аффилированного основателя Американской ассоциации сердца [12GRNT12060233] и Сильного детского исследовательского центра в Рочестерском университете.

Materials

Protean II mini-gel chamber Biorad 1658004 Complete set to pour and run mini-gel electrophoresis
Protean XL maxi-gel Biorad 1653189 Complete set to pour and run maxi-gel electrophoresis
Gradient maker, Hoefer SG15 VWR 95044-704 Pouring mini-gel gradients
Gradient maker, maxi-gel VWR GM-100 Pouring maxi-gel gradients
Transfer kit Biorad 1703930 Complete set to wet transfer of proteins onto membranes
Electroeluter model 422 Biorad 1652976 Electroelution of proteins from native or SDS PAGES
Glass plates Biorad 1653308 Short plates
Glass plates Biorad 1653312 Spacer plates
Glass plates Biorad 1651823 Inner plates
Glass plates Biorad 1651824 Outer Plates
Power supply Biorad 1645070 Power supply suitable for native electrophoresis
ECL-Western  Thermo Scientific 32209 Chemolumniscense substrate
SuperSignal-West Dura Thermo Scientific 34075 Enhanced chemolumniscense substrate
Film/autoradiography film GE Health care 28906845 Documentation of Western blots
Film processor CP1000 Agfa NC0872640
Canon Power Shot 640  Canon NA Taking photos to document gels, membranes and blots.
Canon Power Shot 640 Camera hood  Canon shielding camera for photos being taken on a light table
Acrylamide/bisacrylamide Biorad 1610148 40% pre-mixed solution
Glycine Sigma G7403
SDS (sodium dodecyl sulfate) Invitrogen 15525-017
Tris-base Sigma T1503 Buffer
Tricine Sigma T0377
Sodium deoxychelate Sigma D66750 Detergent
EDTA Sigma E5134
Sucrose Sigma S9378
MOPS Sigma M1254 Buffer
Imidazole Sigma I15513 Buffer
Lauryl maltoside Sigma D4641 Detergent
Coomassie G250 Biorad 161-0406
Aminohexanoic acid Sigma O7260
Native  molecular weight kit GE Health care  17-0445-01 High molecular weight calibraition kit for native electrophoresis.
Name Company Catalog Number Comments
NADH Sigma N4505
Nitroblue tetrazolium Sigma N6639
Tris HCL Sigma T3253
ATP   Sigma A2383
Name Company Catalog Number Comments
Lead(II) nitrate (Pb(NO3)2): Sigma 228621
Oligomycin Sigma O4876
Name Company Catalog Number Comments
Ponceau S Sigma P3504
anti-ATP5A Abcam ab14748 antibody to ATP synthase subunit ATP5A
anti-NDUFB6 Abcam ab110244 antibody to Cx-1 subunit NDUFB6
anti-VDAC Calbiochem 529534 antibody to VDAC
ECL HRP linked antibody GE Health Care NA931V secondary antibody to ATP5A, NDUFB6 and VDAC
Blocking reagent Biorad 170-6404
BSA
sodium chloride Sigma S9888
potassium chloride Sigma P9541
EGTA Sigma E3889
Name Company Catalog Number Comments
Silver staining Kit Invitrogen LC6070

References

  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330 (2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson’s disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

Play Video

Cite This Article
Beutner, G., Porter Jr., G. A. Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution. J. Vis. Exp. (124), e55738, doi:10.3791/55738 (2017).

View Video