رواية مقاييس لوصف الجنينية الاستطالة للنيماتودا<em> انواع معينة ايليجانس</em
Summary
Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.
Abstract
Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.
Introduction
منذ ما يقرب من 50 عاما الديدان الخيطية انواع معينة ايليجانس ضعت نفسها كنموذج قوية لدراسة المسائل الهامة في عملية التنمية، بيولوجيا الأعصاب، والتطور، والتفاعلات المضيف الممرض، الخ. 1 إن قوة هذا النموذج في دراسة التطور تكمن في: دورة حياة قصيرة من 3 أيام؛ السهولة التي هذه الحيوانات يمكن تعديلها وراثيا. شفافيتها التي تمكن من مراقبة النزوح الخلية ومورفولوجيا في الحيوانات الحية وتطورها التي هي في معظمها خارج الرحم. مراحل تطور من الديدان الخيطية وتشمل مرحلة التطور الجنيني وأربع مراحل اليرقات (L1 إلى L4)، تليها مرحلة البلوغ. أثناء التطور الجنيني، ولفت البشرة التشكل اهتماما كبيرا لقدرته على تمكين فهم أفضل لكيفية الظهارية تهاجر الخلايا كمجموعة، كيف تعيد تنظيم تقاطعات وتعديل التشكل الفردي وكذلك تحديد المواقع النسبية في غضون ظهارة الوظيفية.ينقسم التشكل البشرة إلى أربع مراحل: إقحام الظهري التي تتمثل في إعادة تنظيم خلايا البشرة الظهرية، ويشار إلى اللحمة. الضميمة بطني، تتمثل في هجرة خلايا الطبقة الجلدية البطنية نحو خط الوسط البطني وبالتالي يغلف الجنين في أحادي الطبقة الخلايا الظهارية. المبكرة والمتأخرة استطالة تحويل الجنين على شكل حبة الفول إلى يرقات الدودي. بعد التشكل، فتحة الجنين وL1 اليرقات تبدأ التغذية باستخدام بكتيريا المتاحة في بيئتهم المباشرة.
وبالتالي استطالة الجنينية هي مرحلة متأخرة من التطور الجنيني. وهو يتألف من تمديد الجنين على طول محورها الطولي والحد من قطرها عرضية. وهذا ينطوي على تعديل الهائل في شكل خلايا الطبقة الجلدية. ينقسم استطالة إلى وقت مبكر، ومرحلة متأخرة. تبدأ المرحلة الأولى في مرحلة فاصلة وتنتهي عندما تبدأ عضلات الجسم الجدار التعاقد في مرحلة 1.75 أضعاف في ثILD من نوع (وزن) الأجنة – الموافق الأجنة التي هي 1.75 أضعاف في طول مقارنة الأجنة غير ممدود. هي التي تحرك العمليات Morphogenic التي تحدث في تلك المرحلة بشكل رئيسي من قبل انكماش حزم الخيطية الأكتين (FBS) الواقعة في القطب القمي من خلايا الطبقة الجلدية التي تدفع استطالة على طول محور انتيرو الخلفي للجنين 2. انكماش FBS هو سيطرة الفسفرة من سلاسل الميوسين الضوء من قبل ثلاثة تحركات LET-502 / ROCK، MRCK-1 وPAK-1 5. مرحلة متأخرة من استطالة، يبدأ عندما تصبح عضلات الجسم الجدار الوظيفية وتبدأ التعاقد. أنها تنطوي على mechanotransduction إشارات من عضلات الجسم الجدار إلى الخلايا الظهرية والطبقة الجلدية البطنية وينتهي عندما يفقس الحيوانات 3.
تتميز العيوب استطالة عموما نسبة الحيوانات الموت كما الأجنة (الفتك الجنينية، التطريز) وتلك القبض على تنميتها كما L1 اليرقات (اليرقات النمط الظاهري القبض، الوقفأ) ويكون أقصر بكثير من وزن. تحديد مرحلة الاعتقال التنموي يتطلب الملاحظة المجهرية للأجنة ميتة والقبض على يرقات 3-6.
وقد تبين مؤخرا أن العديد من الجينات، مثل Cdc42 / منظم راك والمستجيب بيكسل-1 وباك-1، مراقبة العمليات morphogenic خلال كلا المبكرة والمتأخرة استطالة 3،7. نحن كما أظهرت مؤخرا أن عمليات morphogenic تختلف على طول المحور انتيرو الخلفي من الأجنة أثناء استطالة في وقت مبكر 3 7. هذه النتائج دافعا لتطوير مقاييس جديدة تستهدف على وجه التحديد مراحل استطالة مبكرة أو متأخرة والمقاييس الأخرى تمكين توصيف مورفولوجية الأجنة على طول محور انتيرو الخلفي أثناء استطالة في وقت مبكر.
تتكون هذه الطرق المبتكرة في قياس طول الأجنة في بداية ونهاية استطالة المبكر، وكذلك عرض على انهوقد وضعت الإعلانات وذيول 7 بروتوكولين أيضا إلى قياس طول اليرقات حديثة الفقس، متزامنة في مرحلة L1 7.
قشر البيض من الأجنة حمايتهم من التعرض للمعاملة هيبوكلوريت قلوية بينما حلت اليرقات والبالغين والبكتيريا الموجودة في وسائل الإعلام الثقافة عن طريق العلاج. ثم يتم استخدام هذا العلاج لتنقية الأجنة من السكان غير متزامنة تحتوي على معظم البالغين تغذية جيدة-8. يستخدم تقييد الغذاء لمزامنة اليرقات حديثة الفقس. قياس طول هذه اليرقات ثم يتم استخدامها للكشف عن العيوب استطالة. ويفضل هذا القياس على قياس اليرقات القبض على لوحات ثقافة لأن اليرقات التي تفقس من غير كامل الأجنة ممدود يمكن استرداد إلى "الطول العادي" عند تغذية ولكن ستحافظ على انخفاض حجمها عندما ألقي القبض عليه في حالة عدم وجود الطعام.
هنا، نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية تمكن من قياس جنيهngth من التمطيط الأجنة وكذلك عرض الرأس والذيل باستخدام الوقت الفاصل بين مدينة دبي للإنترنت المجهري وتحليل الصور (بروتوكول 1). ونحن نقدم أيضا بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لقياس طول اليرقات متزامنة باستخدام تحليل الصور (بروتوكول 2) والانسياب الخلوي (بروتوكول 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول مقاييس جديدة للتميز في وقت مبكر ومراحل متأخرة من استطالة الجنينية.
في الباب 1، الخطوة الحاسمة هي احتمال وجود البكتيريا على لوحة. وأرفقت الأجنة بإحكام بين لوحة وساترة خلال الحصول على الصور. ختم الشريحة هو مطلوب ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| high fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. 遗传学. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. 遗传学. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. . Methods. , 587-606 (1988).
- Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
