Novel Metrics à Caractériser Embryonic Allongement du nématode<em> Caenorhabditis elegans</em

Depuis près de 50 ans , les nématodes Caenorhabditis elegans est établi comme un modèle puissant pour étudier des questions importantes dans le développement, la neurobiologie, l' évolution, les interactions hôte-pathogène, etc. ¹ La force de ce modèle dans l'étude du développement réside dans: son cycle de vie court de 3 jours; la facilité avec laquelle ces animaux peuvent être génétiquement modifiées; sa transparence qui permet l'observation du déplacement de la cellule et de la morphologie des animaux vivants et de son développement qui est la plupart du temps extra-utérine. Les stades de développement du nématode impliquent l'embryogenèse et quatre stades larvaires (L1 à L4), suivie par l'âge adulte. Au cours du développement embryonnaire, épidermique morphogenèse a attiré une attention considérable pour sa capacité à permettre une meilleure compréhension de la façon dont épithéliales cellules migrent en tant que groupe, comment ils réorganisent leurs jonctions et modifier leur morphologie individuelle, ainsi que leur positionnement relatif dans un épithélium fonctionnel.Epidermal morphogenèse est divisé en quatre étapes: intercalation dorsale consistant en la réorganisation des cellules épidermiques dorsale, appelée l'hypoderme; enceinte ventrale, consistant à la migration des cellules hypodermiques ventrale vers la ligne médiane ventrale enrobant ainsi l'embryon dans une monocouche de cellules épithéliales; début et fin de l'allongement transformer l'embryon en forme de haricot en larves vermiform. Après morphogenèse, embryon éclosent et les larves L1 commencent à se nourrir en utilisant des bactéries disponibles dans leur environnement immédiat.

allongement embryonnaire est donc une phase tardive du développement embryonnaire. Il est constitué de l'extension de l'embryon, le long de son axe longitudinal, et une réduction de son diamètre transversal. Cela implique une modification spectaculaire de la forme des cellules hypodermiques. Allongement est divisé en un début et une phase tardive. La première phase commence au stade de la virgule et se termine lorsque les muscles corps à parois commencent à contracter à l' étape 1.75 fois dans wild type ( en poids) des embryons – correspondant à des embryons qui sont 1,75 fois la longueur par rapport à des embryons non-allongée. Morphogenèse se produisant à ce stade sont principalement motivés par la contraction des faisceaux filamenteux d'actine (FB) situés au pôle apical des cellules hypodermiques qui conduisent leur allongement le long de l'axe antéro-postérieur de l'embryon ^2. Contraction de FBs est le contrôle par phosphorylation des chaînes de myosine-lumière par trois kinases LET-502 / ROCK, MRCK-1 et PAK-1 ^5. La phase tardive de l'allongement, commence lorsque les muscles corps à parois deviennent fonctionnels et commencent à contracter. Elle implique la signalisation de transduction mécanique des muscles corps de paroi aux cellules dorsale et ventrale hypodermiques et se termine lorsque les animaux éclosent ^3.

les défauts de Allongement sont généralement caractérisés par le pourcentage d'animaux qui meurent comme des embryons (létalité embryonnaire; Emb) et ceux d'arrêter leur développement en tant L1 larves (larvaire arrestation phénotype; Lva) et étant sensiblement plus courte que poids. Identification de la scène de l' arrestation de développement nécessite une observation microscopique des embryons morts et arrêté Larves ^3-6.

Il a été récemment montré que plusieurs gènes, comme le régulateur / Cdc42 Rac et effecteur pix-1 et pak-1, contrôlent la morphogenèse au cours précoce et tardive allongement ^3,7. Nous avons récemment montré que morphogenèse diffèrent selon l'axe antéro-postérieur de l'embryon lors de l' allongement précoce ^{3 7.} Ces résultats ont motivé l'élaboration de nouvelles mesures ciblant spécifiquement les étapes d'allongement précoce ou tardive et d'autres mesures permettant la caractérisation de la morphologie des embryons le long de leur axe antéro-postérieur lors de l'allongement précoce.

Ces nouveaux procédés consistent à mesurer la longueur des embryons au début et à la fin de l'allongement précoce, ainsi que la largeur de leur ilannonces et les queues. ⁷ Deux protocoles ont également été développés pour mesurer la longueur des larves nouvellement écloses, synchronisé à l' étape L1 ^7.

Les coquilles des embryons de les protéger contre le traitement d'hypochlorite alcalin alors que les larves, les adultes et les bactéries présentes dans les milieux de culture sont dissous par le traitement. Ce traitement est ensuite utilisé pour purifier les embryons provenant d' une population non synchronisée contenant une majorité des adultes bien nourris ^8. La restriction alimentaire est utilisé pour synchroniser les larves nouvellement écloses. Mesurer la longueur de ces larves est ensuite utilisé pour détecter des défauts d'allongement. Cette mesure est préférable à la mesure des larves arrêtés sur des plaques de culture parce que les larves qui éclosent de non-entièrement embryons allongés peut récupérer à "longueur normale" lors de l'alimentation, mais maintiendra leur taille réduite lors de son arrestation en l'absence de nourriture.

Ici, nous présentons des protocoles détaillés permettant la mesure du chierngth d'allonger les embryons ainsi que la largeur de la tête et la queue à l'aide de time-lapse DIC microscopie et l'analyse de l'image (Protocole 1). Nous fournissons également des protocoles détaillés pour mesurer la longueur des larves synchronisée par analyse d'image (protocole n ° 2) et Flow-cytométrie (protocole n ° 3).