Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek<em> Caenorhabditis elegans</em
Summary
Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.
Abstract
Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.
Introduction
Kısa yaşam döngüsü: Yaklaşık 50 yıldır nematod Caenorhabditis elegans gelişimi, nörobiyoloji, evrim, konukçu-patojen etkileşimleri, vb önemli soruları incelemek için güçlü bir model olarak kendini kabul ettirdi 1 gelişme çalışmada bu modelin gücü yatıyor 3 gün; bu hayvanlar genetik olarak değiştirilmiş olabilir hangi ile kolaylığı; Çoğunlukla rahim dışı olduğunu yaşayan hayvanların ve gelişimi, hücre deplasman ve morfolojisi gözlem sağlayan şeffaflığı. nematod gelişim evreleri yetişkinlikte ardından embriyogenezis ve dört larva aşamalarını (L4 L1), içerir. embriyonik gelişim sırasında, epidermal morfogenezisi hücreleri onların kavşak yeniden nasıl bir grup olarak göç nasıl epitel daha iyi anlaşılmasını sağlamak ve onların bireysel morfolojisi yanı sıra işlevsel epitel içinde göreceli konumunu değiştirmek kabiliyetini önemli ölçüde dikkat çekti.Epidermal morfogenezisi dört evreye ayrılır: dorsal epidermal hücrelerin yeniden organizasyonunda oluşan sırt interkalasyon, hipodermis olarak anılacaktır; böylece epitel hücre tek tabaka embriyo encasing ventral orta hat doğru ventral hipodermal hücrelerinin göç oluşan ventral muhafaza; erken ve geç uzama vermiform larva haline fasulye şeklinde embriyoyu dönüştürme. Aşağıdaki morfogenezi, embriyo kapak ve L1 larvaları kendi yakın çevrede mevcut bakterileri kullanarak beslemeye başlarlar.
Embriyonik uzama nedenle embriyonik gelişim geç bir aşamasıdır. Bu uzunlamasına ekseni boyunca embriyo uzatılması ve enine çapa sahip bir azalma oluşur. Bu hipodermal hücre şeklinin dramatik bir değişiklik gerektirir. Uzama, erken ve geç faz ayrılmıştır. Vücut duvarı kasları w 1.75 kat aşamada sözleşme başladığınızda erken evre virgül aşamasında başlar ve biterILD tipi (WT) embriyo – olmayan uzatılmış embriyolar göre uzunluğu 1.75 kat olan embriyolar tekabül etmektedir. Bu aşamada ortaya çıkan morfojenik süreçler esas embriyo 2 anteroposterior ekseni boyunca onların uzama sürücü hipodermal hücrelerinin apikal kutbunda bulunan ipliksi aktin demetleri (FB'ler) kasılmasıyla tarafından tahrik edilmektedir. FBs Daralma üç kinazlar LET-502 / ROCK, MRCK-1 ve PAK-1 5 ile miyozin-hafif zincirlerin fosforilasyon ile kontrol edilmesidir. vücut duvarı kasları işlevsel hale ve taahhüt başlattığınızda uzama geç faz başlar. Bu sırt ve karın hipodermal hücrelere vücut duvarı kasları gelen mechanotransduction sinyalizasyon içerir ve hayvanlar 3 yumurtadan biter.
ve L1 larvaları (Larva tutuklama fenotip olarak bu durdurma onların gelişimi; uzama kusurları genellikle embriyolar olarak ölen hayvanların yüzdesi (Emb Embriyonik öldürücü); ile karakterize edilir Lva) ve ağırlık önemli ölçüde daha kısa olması. gelişimsel duraklama evresi tanımlanması ölü embriyo mikroskobik gözlem gerektirir ve Larva 3-6 tutukladı.
Son zamanlarda, bu Cdc42 / rac regülatörü ve efektör pix-1 ve Pak-1 gibi birçok gen, erken ve geç uzama 3,7 sırasında hem morfojenik süreçlerini kontrol gösterilmiştir. Biz de son zamanlarda morfojenik süreçler erken uzama 3 7 sırasında embriyoların anteroposterior ekseni boyunca farklı olduğunu gösterdi. Bu bulgular, özellikle erken uzama sırasında ön-arka eksen boyunca embriyoların morfolojik karakterizasyonu sağlayan erken ya da geç uzama aşamalarını ve diğer ölçümleri hedefleyen yeni metrik gelişimini motive etti.
Bu yeni yöntemler kendi genişliği yanı sıra başında ve erken uzama sonunda embriyoların uzunluğu ölçülerek ibaret oreklamlar ve kuyrukları. 7 İki protokolleri de L1 aşamada 7'de senkronize yumurtadan yeni çıkmış larvaların uzunluğunu ölçmek için geliştirilmiştir.
larva, yetişkin ve kültür ortamı mevcut bakteri tedavisi ile çözülür ise embriyoların yumurta kabukları alkali hipoklorit muameleye karşı korunmaları. Bu işlem daha sonra besili yetişkin 8 çoğunluğunu ihtiva eden bir senkronize olmayan nüfusu embriyolar saflaştırmak için kullanılır. Gıda kısıtlama yeni yumurtadan larva senkronize etmek için kullanılır. Bu larvaların uzunluğunun ölçülmesi sonra uzama kusurları tespit etmek için kullanılır. yumurtadan larva olmayan tam olarak uzatılmış embriyolar beslerken, "normal uzunluğu" olarak geri ancak gıda yokluğunda yakalandıklarında indirgenmiş büyüklüğünü korumak çünkü bu ölçüm kültür levhaları üzerinde tutuklandı larva ölçülmesi tercih edilmektedir.
Burada, biz le ölçümünü sağlayan ayrıntılı protokolleri mevcutzaman atlamalı DIC mikroskopi ve görüntü analizi (Protokol 1) kullanılarak embriyolar ve bunların baş genişliği ve kuyruk uzatılması ngth. Biz de görüntü analizi (Protokol 2) ve Flow-Sitometri (Protokol 3) kullanılarak senkronize larva uzunluğunu ölçmek için ayrıntılı protokolleri sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol erken karakterize etmek roman ölçümleri ve embriyonik uzama geç evreleri açıklar.
1. bölümde, kritik bir adım pad üzerinde bakteri potansiyel varlığıdır. Embriyolar hermetik pad ve görüntü alımı sırasında lamel arasında içine alınır. slayt Sızdırmazlık iki saatten fazla süren edinimi sırasında hayvanların kuruma önlemek için gereklidir. Bildiğimiz kadarıyla, slayt ve lamel arasındaki agaroz pedleri monte etmek için kullanılan sızdırmazlık…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| high fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. 遗传学. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. 遗传学. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. . Methods. , 587-606 (1988).
- Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
