מדדי רומן לאפיון התארכות עוברית של נמטודות<em> Elegans Caenorhabditis</em
Summary
Here we detail protocols specifically designed to monitor morphogenic defects that occur during early and late phases of embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans. Ultimately, these protocols are designed to identify genes that regulate these phases and to characterize their differential requirements along the antero-posterior axis of the embryo.
Abstract
Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. Embryonic elongation of the nematode Caenorhabditis elegans is a late developmental stage consisting of the elongation of the embryo along its longitudinal axis. This developmental stage is controlled by intercellular communication between hypodermal cells and underlying body-wall muscles. These signaling mechanisms control the morphology of hypodermal cells by remodeling the cytoskeleton and the cell-cell junctions. Measurement of embryonic lethality and developmental arrest at larval stages as well as alteration of cytoskeleton and cell-cell adhesion structures in hypodermal and muscle cells are classical phenotypes that have been used for more than 25 years to dissect these signaling pathways. Recent studies required the development of novel metrics specifically targeting either early or late elongation and characterizing morphogenic defects along the antero-posterior axis of the embryo. Here, we provide detailed protocols enabling the accurate measurement of the length and the width of the elongating embryos as well as the length of synchronized larvae. These methods constitute useful tools to identify genes controlling elongation, to assess whether these genes control both early and late phases of this stage and are required evenly along the antero-posterior axis of the embryo.
Introduction
במשך כמעט 50 שנים elegans Caenorhabditis נמטודות ביססה את עצמה כמודל רב עוצמה כדי לחקור שאלות חשובות בפיתוח, נוירוביולוגיה, אבולוציה, אינטראקציות הפתוגן המארח, וכו '1 עוצמת המודל הזה בחקר התפתחות טמון: מחזור החיים הקצר שלה של 3 ימים; הקלות שבה החיות האלה ניתן לשנות גנטיות; השקיפות שלה המאפשר התצפית של עקירת תא ומורפולוגיה בחיות חיים והתפתחותה כי הוא בעיקר רחמית נוספת. שלבי ההתפתחות של נמטודות לערב עובר וארבעה שלבי זחל (L1 כדי L4), ואחריו לבגרות. במהלך התפתחות עוברית, morphogenesis אפידרמיס משך תשומת לב רבה ביכולתה לאפשר הבנה טובה יותר של איך אפיתל תאי נודדים כקבוצה, איך הוא מחדש צומת שלהם ולשנות המורפולוגיה האישית שלהם, כמו גם המיקום היחסי שלהם בתוך האפיתל פונקציונלי.morphogenesis עוריות מחולק לארבעה שלבים: עיבור הגבה מורכב בארגון מחדש של תאי אפידרמיס הגבה, המכונה hypodermis; מתחם גחון, מורכב נדידת תאי hypodermal גחון כלפי קו אמצע הגחון ובכך עוטף את העובר בתוך monolayer תא אפיתל; מוקדם התארכות מאוחר הפיכה העובר בצורת השעועית לתוך זחלים דמויים תולעת. בעקבות morphogenesis, צוהר עובר וזחלי L1 להתחיל להאכיל באמצעות חיידקים זמינים בסביבה המיידית שלהם.
ההתארכות עוברית היא אפוא שלב מאוחר של ההתפתחות העוברית. הוא מורכב ההארכה העובר לאורך ציריו אורך הפחתה של הקוטר הרוחבי שלה. זה כרוך שינוי דרמטי של צורת התאים hypodermal. ההתארכות מחולקת צעיר ושלב מאוחר. השלב מוקדם מתחיל בשלב פסיק ומסתיים כאשר השרירים-קיר הגוף מתחיל לחלות בשלב 1.75 של פי wהכשרת הישוב מסוג (WT) עוברים – המתאים עוברים כי הם 1.75 פי אורך לעומת עוברים שאינם מוארך. תהליכים המתרחשים morphogenic בשלב זה מונעים בעיקר על ידי התכווצות של חבילות אקטין פילמנטיות (FBS) ממוקם בקוטב הפסגה של תאי hypodermal שמניעים התארכות שלהם לאורך ציר אנטרו-האחורי של העובר 2. התכווצות של FBS היא שליטה על ידי זרחון של שרשרות אור שרירן ידי שלוש קינאזות LET-502 / ROCK, MRCK-1 ו- PAK-1 5. השלב המאוחר של ההתארכות, מתחיל כאשר שרירי גוף לקיר להיות פונקציונליים ולהתחיל קבלנות. היא כרוכה איתות mechanotransduction מהשרירים-קיר הגוף אל hypodermal הגב ועל הגחון תאים ומסתיימת כאשר חיות לבקוע 3.
פגמי התארכות מאופיינים לרוב אחוז בעלי החיים מתים כמו עוברי (הקטלני עוברי; Emb) ואלה התפתחותם מעצר כזחלי L1 (פנוטיפ מעצר זחל; Lvא) ולהיות קצרים משמעותי מאשר WT. זיהוי של השלב של מעצר התפתחותי דורש תצפית מיקרוסקופית של עוברים מתים ועוצר זחלי 3-6.
היא הוצגה לאחרונה כי מספר גנים, כגון רגולטור Cdc42 / Rac ו Pix-1 המפעיל ו פאק-1, לשלוט בתהליכי morphogenic במהלך שני מוקדמת ומאוחר התארכות 3,7. הראנו גם לאחרונה שתהליכים morphogenic שונים לאורך ציר אנטרו-האחורי של העוברים במהלך התארכות מוקדם 3 7. ממצאים אלה הניעו את הפיתוח של מדדי רומן מיקוד בשלבי התארכות מוקדם או מאוחר במיוחד ומדדים אחרים, המאפשרים אפיון של המורפולוגיה של עובר לאורך ציר אנטרו-האחורי שלהם במהלך ההתארכות מוקדם.
שיטות חדשניות אלה מורכבות במדידת האורך של עובר בתחילה ובסוף של התארכות מוקדם וכן את הרוחב שלהם הןמודעות וזנבות. 7 שני פרוטוקולים פותחו גם למדוד את אורך הזחלים שבקעו זה עתה, מסונכרן ב L1 בשלב 7.
קליפות הביצים של עובר להגן עליהם מפני טיפול תת-כלורי אלקליין בעוד זחלים, מבוגרים חיידקים נוכחיים בתקשורת התרבות, נמוגים ידי הטיפול. טיפול זה משמש אז כדי לטהר עובר מתוך אוכלוסייה הלא מסונכרן המכילה מרבית מבוגרים הניזונים גם 8. הגבלת מזון משמשת לסנכרן זחלים שבקעו זה עתה. מדידת אורך הזחלים אלה לאחר מכן נעשה שימוש כדי לזהות פגמי התארכות. מדידה זו עדיפה על פני מדידת זחלים נעצרו על צלחות התרבית כי זחלים בוקעים מן הלא-לגמרי עוברים מוארכים יכולים להתאושש כדי "אורך נורמלי" כאשר האכלה אך ישמרו בגודל המוקטן שלהם כאשר נעצרו בהיעדר מזון.
כאן, אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים המאפשרים מדידה של length של מתארך עובר כמו גם את רוחב הראש שלהם וזנב באמצעות זמן לשגות דסק"ש מיקרוסקופיה וניתוח תמונה (פרוטוקול 1). כמו כן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים כדי למדוד את אורך זחלים מסונכרנים באמצעות ניתוח תמונה (פרוטוקול 2) ושפל-Cytometry (פרוטוקול 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר מדדי רומן לאפיין מוקדם שלבים מאוחר של התארכות עוברית.
בסעיף 1, השלב הקריטי הוא הימצאות אפשרית של חיידקים על כן השיגור. העוברים מוקפים הרמטית בין המשטח ואת coverslip במהלך רכישת תמונה. איטום המגלשה נדרש להימנע התייבשות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada and The Canada Foundation for Innovation. Thanks to Dr Paul Mains (University of Calgary, Calgary, Canada) for let-502(sb118ts) strain. Some of the strains were provided by the Caenorhabditis Genetics Center, which is funded by NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440).
Materials
| Agar | BioShop | AGR001.500 | |
| Agarose | Bioshop | AGA001.500 | |
| CaCl2 (calcium chloride) | Bio Basic Inc. | CT1330 | |
| Cholesterol | Sigma-aldrich | C8667 | |
| cleaning solution | union Biometrica | 300-5072-000 | |
| glass coverslips | Fisherbrand | 12-542B | |
| glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
| high fluorescent control particles | union Biometrica | 310-5071-001 | |
| K2HPO4 (potassium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | PB0447 | |
| KH2PO4 (potassium phosphate, monobasic) | Bio Basic Inc. | PB0445 | |
| MgSO4 (magnesium sulfate) | Sigma-aldrich | 230391 | |
| Na2HPO4( sodium phosphate, dibasic) | Bio Basic Inc. | SDB0487 | |
| NaCl (sodium chloride) | Bio Basic Inc. | DB0483 | |
| Pebeo Drawing Gum 45ml | pébéo | PDG033000 | any art/craft store |
| Peptone | BioShop | PEP403.500 | |
| Sheath buffer | union Biometrica | 300-5070-100 | |
| COPAS Biosort | union Biometrica |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A Transparent Window into Biology: A Primer on Caenorhabditis elegans. 遗传学. 200, 387-407 (2015).
- Priess, J. R., Hirsh, D. I. Caenorhabditis elegans morphogenesis: the role of the cytoskeleton in elongation of the embryo. Developmental biology. 117, 156-173 (1986).
- Zhang, H., et al. A tension-induced mechanotransduction pathway promotes epithelial morphogenesis. Nature. 471, 99-103 (2011).
- Diogon, M., et al. The RhoGAP RGA-2 and LET-502/ROCK achieve a balance of actomyosin-dependent forces in C. elegans epidermis to control morphogenesis. Development. 134, 2469-2479 (2007).
- Gally, C., et al. Myosin II regulation during C. elegans embryonic elongation: LET-502/ROCK, MRCK-1 and PAK-1, three kinases with different roles. Development. 136, 3109-3119 (2009).
- Piekny, A. J., Wissmann, A., Mains, P. E. Embryonic morphogenesis in Caenorhabditis elegans integrates the activity of LET-502 Rho-binding kinase, MEL-11 myosin phosphatase, DAF-2 insulin receptor and FEM-2 PP2c phosphatase. 遗传学. 156, 1671-1689 (2000).
- Martin, E., et al. pix-1 controls early elongation in parallel with mel-11 and let-502 in Caenorhabditis elegans. PloS one. 9, e94684 (2014).
- Sulston, J., Hodgkin, J., Wood, W. B. . Methods. , 587-606 (1988).
- Andersen, E. C., et al. A Powerful New Quantitative Genetics Platform, Combining Caenorhabditis elegans High-Throughput Fitness Assays with a Large Collection of Recombinant Strains. G3 (Bethesda). 5, 911-920 (2015).
- Boulier, E. L., Jenna, S. Genetic dissection of Caenorhabditis elegans embryogenesis using RNA interference and flow cytometry. Methods Mol Biol. 550, 181-194 (2009).
- Verster, A. J., Ramani, A. K., McKay, S. J., Fraser, A. G. Comparative RNAi screens in C. elegans and C. briggsae reveal the impact of developmental system drift on gene function. PLoS genetics. 10, e1004077 (2014).
- Ramani, A. K., et al. The majority of animal genes are required for wild-type fitness. Cell. 148, 792-802 (2012).
- So, S., Miyahara, K., Ohshima, Y. Control of body size in C. elegans dependent on food and insulin/IGF-1 signal. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 16, 639-651 (2011).
- Dineen, A., Gaudet, J. TGF-beta signaling can act from multiple tissues to regulate C. elegans body size. BMC developmental biology. 14, 43 (2014).
- Tan, L., Wang, S., Wang, Y., He, M., Liu, D. Bisphenol A exposure accelerated the aging process in the nematode Caenorhabditis elegans. Toxicology letters. 235, 75-83 (2015).
- Yu, Z., Yin, D., Deng, H. The combinational effects between sulfonamides and metals on nematode Caenorhabditis elegans. Ecotoxicology and environmental safety. 111, 66-71 (2015).
