This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.
Bitkiler ve yeşil algler, ışık, ışık hasat kompleksleri (LHCs), klorofiller ve karotenoidler koordinat bütün zar proteinlerinin, bir ailesi tarafından yakalanır. In vivo olarak, bu proteinler Tilakoid zarının eklenir kompleksler oluşturmak üzere pigmentler içeren katlanır kloroplastın. Birlikte kolayca izolasyonu sırasında pigmentler kaybedebilir gerçeği ile ailenin üyeleri, kimyasal ve fiziksel özellikleri, yüksek benzerlik, bir doğal halde saflaştırılması zor hale getirir. LHCs arasında homojen terkiplerinin elde edilmesi için alternatif bir yaklaşım, bu natif çok benzer özelliklere sahip kompleksler sonuçlanan saflaştırılmış pigmentler ve katlanmamış, apolar başlayarak bu in vitro kompleksleri tekrar oluşturmak için mümkün olduğunu gösterdi, 1987 1 Plumley ve Schmidt geliştirilmiştir kompleksleri. Bu in vitro bakteriyel eksprese edilen rekombinant proteinlerin kullanımına yol açtı </em> sulandırma. Yeniden oluşturma yöntemi, çeşitli nedenlerle güçlüdür: (1) tek tek komplekslerinin saf müstahzarları ile elde edilebilir, (2) bir pigment bileşimi yapı ve fonksiyon etkilerinin değerlendirilmesi için kontrol edilebilir, (3) bir araya getiren proteinler fonksiyonel incelemek için mutasyona uğratılabilir tek tek kalıntılarında (örneğin, pigment bağlama bölgeleri) veya protein domaini (örneğin protein-protein etkileşimi, katlama) rolü. Bu yöntem, çeşitli laboratuvarlarda optimize edilmiş ve ışık hasat kompleksi en uygulanmıştır. Burada açıklanan protokol, şu anda laboratuvarda kullanılan in vitro ışık hasat kompleksleri yeniden yapılandırma yöntemi ayrıntıları ve yöntem uygulamaları açıklayan örnekler verilmektedir.
Bitki ve alglerin fotosentez cihazı integral membran (chl a) klorofil a bağlayan proteinleri b (chl b) ve karotenoidler (araba) bulunmaktadır. Bu pigment-protein kompleksleri hasat ışık enerjisi ve şarj ayırma 2 teşvik etmek için kullanılan reaksiyon merkezleri, bu uyarım enerji aktarmak aktiftir. Bunlar ayrıca, yüksek ışık hasarına 3,4 'den fotosentetik düzenek korumak düzenleyici geri besleme mekanizmalarının katılmaktadırlar. Işık hasat kompleksi (LHCs) bitkiler ve yosun 5 ilişkili proteinlerin büyük bir ailenin oluşmaktadır.
Ailenin her bir üyesinin öznel homojen saflaştırma komplekslerinin çok benzer kimyasal ve fiziksel özellikleri daha karmaşık hale gelmiştir. Buna ek olarak, saflaştırma işlemleri çoğu zaman, lipidler, pigment ya da başka yardımcı faktörler potansiyel kaybı ile sonuçlanabilir. In vitro yeniden oluşum Represents güçlü bir yöntem bu sorunların üstesinden gelmek için. Fotositem II'nin (BHÇ-II) ile bağlantılı LHC ilk araştırmacılar bitki kloroplast ayrı delipide protein ve pigment ekstre edilmiştir. 1987 1 Plumley ve Schmidt in vitro yeniden ve daha sonra lityum mevcudiyetinde pigmentler ile ısıyla denatüre proteini birleştirildi dondurma ve eritme 1 üç döngü izledi dodesil sülfat (LDS). Bunlar, yeniden oluşturulmuş LHC komplekslerinin spektral özellikleri bitkilerden arıtıldı kompleksleri çok benzer olduğunu gösterdi. Organizmalardan saflaştırılmış komplekslerini izole edilmesindeki güçlük, birlikte, bağlı bazı içsel kendi kendine bağlanma özelliği BHÇ pigment protein kompleksleri, muhtemelen yeniden yapılandırma kolaylığı, başka araştırmacılar tarafından, yöntemin pratik kabul edilmesine yol açmıştır. Escherichia coli (E. coli) aşın fotosentetik proteinlerin yeniden oluşturma 6 Paulsen 1990 ve meslektaşları tarafından elde edilmiştir. E'deE. coli, aşın zar proteinleri, genellikle, inklüzyon cisimcikleri içinde yer alır tesisleri için saflaştırma. Sulandırma, protein katlanmasını başlatır pigmentlerin ilave edildi LDS varlığında yeniden birleştirici protein içeren inklüzyon gövdelerinin yalıtılması, ısıl denatürasyonu ile elde edilir. LHCII kompleksinin katlanması, iki aşamalı bir işlemdir: ilk olarak, klorofil a 1 dakikadan daha az olarak bağlanmıştır; ikinci, klorofil b birkaç dakika 7 üzerine bağlanmış ve stabilize edilir.
Katlama dinamikleri ilişkin bilgi temin edilmesine ilave olarak, yer yönelimli mutagenez ile kombine tüpte yeniden spesifik amino asitlerin stabilitesi için önemlidir (örneğin, 8,9) ya da pigment koordinasyon tanımlanmasını sağladı (örneğin, 10). Böyle pigment kompozisyon ya da deterjan gibi parametreleri ayarlayarak tekrar katlama koşulları Manipülasyon da unsurları Critica belirledikBöyle LHCII kompleksi için Ksantofiller gereği olarak doğru katlanması, l (örneğin, 1,11). Buna ek olarak, komplekslerine bağlanmış bireysel pigmentlerin özelliklerinin incelenmesi, in vivo olarak yeniden kompleksleri kullanılarak mümkün olmuştur (örneğin, 10).
Burada açıklanan yöntem pigmentler izolasyonu (klorofil ve karotenoid) ıspanaktan ve yeşil deniz yosunu Chlamydomonas reinhardtii ile başlar. E. LHC proteinin ifadesi ve saflaştırılması inklüzyon cisimcikleri formunda Coli sonra Ni afinite kolonu ile LHC'in yeniden oluşturulması ve daha sonra, ardından arıtma için, ayrıntılı olarak verilmiştir. Son aşamada, yeniden oluşturulmuş kompleksleri ayrıca serbest pigmentler ve katlanmamış apoprotein kaldırmak için sukroz gradyanlı santrifüjleme vasıtasıyla saflandırılır. Bu protokol üzerinde farklı laboratuvarlar tarafından tanıtıldı çeşitli değişiklikler içeren bir optimize prosedürünü temsilzaman 1,6,10,12 -14.
Membran proteinleri çalışmak çok kolay değil. Doğal zar proteinlerinin izolasyonu protein zarar verebilir ve temel kofaktör kaldırmak deterjanlarla lipid çift katmanından çözündürülmesi için ihtiyacı karmaşık hale gelir. Bu proteinler ayrıca biyolojik zarların düşük seviyelerde mevcut olabilir, ya da zor tek komplekslerinin saflaştırılması kılan hafif hasat kompleks durumunda olduğu gibi, yakın ilişkili proteinler ile karıştırılabilir. E. coli 'de heterolog protein ekspresyonu E. coli ve in vitro yeniden yapımında Bu sorunları önlemek için imkanı sunar. in vitro homojenliğe 24 saflaştırılarak edilemez kompleksleri incelemek için kullanılabilir doğal kompleksleri 20,21,23 ve dolayısıyla çok benzer özelliklere sahip kompleksleri sulandırılması ve katlanmış proteinler, sonuç saflaştırılması – 27.
Bu yöntem attainab kolaylıkla, ıspanak, kullanırtoplam pigment ve karotenoid hazırlıkları için bir kaynak olarak le yıl boyunca,. Yosunlar için nativ proteinlerin bazı reconstitutions, yosunlar saflaştırılmış pigmentlerin kullanılması nedeniyle farklı pigment bileşimler tercih edilir. Chl a / b oranı ve Chl / otomobil oranı ne olursa olsun, pigment kaynağı aynı kalır.
Bu sulandırma verimliliği genellikle% 35 civarındadır 28 olduğunu fark etmek önemlidir. Bu nedenle, yeniden oluşumun ardından çözeltiden Bağlı olmayan pigmentler ve katlanmamış apoprotein kaldırmak için gereklidir. Iki aşamalı bir saflaştırma protokolü (ayrıca sonuçları bakınız), bu protokolde sunulmuştur. Bununla birlikte, sukroz gradyanlı adım APO ve sanal-proteinin tam olarak ayrılmasına izin vermez unutulmamalıdır. Apoprotein fonksiyonel ölçülerde müdahale etmeyen, böylece pigmentler ihtiva etmez ve en gibi analizler için bu bir sorun değildir. Bununla birlikte, bu durumda, tamamen fr apoprotein kaldırmak için gereklidiryeniden kompleksi (örneğin protein stoikiometriye pigment hesaplamak için) ihtiva eden işlem, bir anyonik değiştirme sütunu (bakınız Passarini ve ark. detayları için 29, 2009) kullanılabilir.
Kapasite in vitro izole edilmiş yeniden birleştirici pigmentler ile ışık toplayıcı proteinlerin yeniden kapatmak için, böylece elde edilen kompleksin özelliklerini değiştirmeden, çeşitli şekillerde yeniden oluşturma "çevre" değiştirerek kompleksleri "ayarlamak" için bir fırsat sağlar. Örneğin, sulandırma sırasında pigment bileşimi değişen değiştirilmiş bir pigment bileşimi ile bir kompleks neden olabilir. Bu özellik, çeşitli pigmentler kompleksinin yapısı ve kararlılığı üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir. 1 ve 2.9 arasında bir Chl / araç oranı l: süresi ıspanak elde edilen pigment preparasyonu 3 bir Chl a / b oranı 1. Bu oran, tipik olarak n ile aynı özelliklere sahip olan bir sulandırma proteini üretirbirini Ative. 33 – Bununla birlikte, arıtılmış, Chl a veya b eklenmesiyle Chl a / b oranı ayarlanması bağlanma yerleri 30 seçiciliği değişken bağlı olarak farklı pigmentlerin bağlayıcı etkileyebilir. Pigment bağlama sitelerinin çoğu Chl a ya da b Chl tamamen selektif değildir, ama her ikisi için uygun olabilir, çünkü bu, mümkün olmasına rağmen, farklı afinite ile 10,30,34. 38 – Benzer şekilde, karotenoid bağlanma yerleri, ayrıca birden Ksantofil tür 8,35 karşılamak mümkün olduğu gösterilmiştir. CP26, çeşitli pigment bileşimleri kullanılarak yüksek bitkiler, diğer pigment-protein kompleksinin farklı reconstitutions Tablo 2'de 39 olarak gösterilmiştir. Bu reconstitutions, özellikle pigmentler 39 için bağlanma afinitesini belirlemek için kullanıldı. Bu aynı pigment c ile bir kompleks elde etmek için dikkat çekicidir1: doğal olarak omposition pigment karışımı Chl a / b oranı 3 olmalıdır. Bu, daha yüksek bitki 20,40 her BHÇ kompleksleri için geçerli görünmektedir.
Yeniden oluşturma tekniği ile, moleküler biyoloji kombinasyonu, Chl bağlayıcı kompleksinin özellikleri daha ayrıntılı olarak incelenecektir sağlar. 44 – kompleksleri, ya da protein-protein etkileşimleri katılımları kararlılığı ve katlanma farklı bir protein alanlarının önemi, apoprotein kesilmesi ya da rastgele mutagenez 8,41 yapılarak belirlenmiştir. 52 – Farklı pigmentlerin koordinasyonu için önemli bir tek amino asit kalıntıları tek tek pigmentlerin özelliklerini analiz ya da kompleks 10,28,29,45 bir fonksiyon ve stabilite etkilerinin değerlendirilmesi için, yer yönlendirmeli mutagenez ile değiştirilebilir. Şekil 6 ile Lhcb4 (CP29) yeniden53, 216 konumunda bir mutasyonu histidin. vahşi tip ve mutant komplekslerinin pigment bileşimin bir karşılaştırması mutasyon hedef sitesi WT kompleksi içinde Chl a barındırır gösteren bir molekül, bir Chl kaybını uyardığını göstermektedir. WT ve mutant absorpsiyon spektrumları arasındaki farklar, pigment içeriğine normalleşmeyi üzerine de kayıp pigmentin emme özelliklerini gösterir. Bu durumda, fark Chl His216 tarafından koordine edilen bu dalga boyunda absorbe eder (bu, mutant ile ilgili daha fazla bilgi için ve spektroskopik özellikleri Mozzo ve ark. 2008 53) gösteren, 680 nm 'de, ana zirve görülebilir. Mutasyon analizi, aynı zamanda pigmentlerin 54 spektroskopik özellikleri üzerindeki çevre etkisini belirlemek için de kullanılabilir.
Sonuç olarak, ışık hasat proteinlerini pigment Protei sonuçlanan in vitro yeniden oluşturulabiliryerli kompleksleri çok benzer özelliklere sahip n kompleksleri. Ayrıca, ileri çalışmalar için yüksek verim ve saflıkta olan bir protein preparasyonunu elde ederlerken, bu şekilde, doğal proteinlerin izole zorlukları ortadan kaldırılır. 3 önemi: otantik bir kompleks oluşturan 1 Chl a / b oranı vurgulanmıştır ve yeniden vahşi tip ve mutant LHCs örnekleri tekniğin kullanımlarını daha fazla açıklamak için verilmiştir.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
HisTrap HP | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
Nylon cloth | 20 μm pores | ||
Soft artists paint brush | |||
NONIDET P-40 | Sigma | 74385 | |
Beta-DM | Sigma | D4641 | |
DNAase | ThermoScientific | EN0525 | |
Milk Powders | |||
RNAase | ThermoScientific | EN0531 | |
Sonicator | |||
Octyl β-D-glucopyranoside | Sigma | O8001 | |
Ultracentrifuge XL | Beckman-Coulter | ||
TAP medium | see reference 17 | ||
LB medium | see reference 19 |