This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.
В растениях и зеленых водорослей, свет захватывается светособирающих комплексов (ВД), семейства интегральных мембранных белков, которые координируют хлорофиллов и каротиноидов. В естественных условиях, эти белки сложил с пигментами образуют комплексы, которые вставляются в мембрану тилакоида хлоропласта. Высокое сходство в химических и физических свойств членов семьи, вместе с тем, что они могут легко потерять пигменты в процессе выделения, делает их очистки в нативном состоянии сложной. Альтернативный подход для получения гомогенных препаратов ВД был разработан Plumley и Шмидта в 1987 году 1, который показал, что можно было восстановить эти комплексы в пробирке, исходя из очищенного пигментов и развернутых апопротеинов, в результате комплексов, обладающих свойствами, очень похожих на что из родной комплексы. Это открыло путь к использованию бактериальных выраженных рекомбинантных белков для в пробирке </eм> восстановление. Способ восстановление является мощным по различным причинам: (1) чистые препараты отдельных комплексов могут быть получены, (2) композиция пигмента может управляться, чтобы оценить их вклад в структуру и функцию, (3) рекомбинантные белки могут быть заменен на изучение функциональной Роль отдельных остатков (например, пигментные сайты связывания) или домена белка (например, белок-белковое взаимодействие, складывающиеся). Этот метод был оптимизирован в нескольких лабораториях и применяется в большинстве из светособирающих комплексов. Протокол, описанный здесь подробности метода воссоздания светособирающих комплексов в пробирке в настоящее время используются в нашей лаборатории, и примеры, описывающие применение метода предусмотрены.
Фотосинтетический аппарат растений и водорослей включают интегральные мембранные белки, которые связываются хлорофилла а (хл), B (хл б) и каротиноиды (CAR). Эти пигмент-белковых комплексов активны в сбор световой энергии и передачи этой энергии возбуждения в реакционных центров, где он используется для продвижения разделение зарядов 2. Они также участвуют в регуляторных механизмов обратной связи, которые защищают фотосинтетический аппарат от высокого легкого вреда 3,4. Комплексы свет уборки (ВД) состоят из большого семейства родственных белков в растениях и водорослях 5.
Однородная очистка каждого члена семьи была осложнена высокой аналогичных химических и физических свойств комплексов. Кроме того, процедуры очистки часто приводит к потере пигментов или других потенциальных кофакторов, таких как липиды. В пробирке восстановление представиTS мощный метод для решения этих проблем. БАК, связанный с фотосистемы II (LHC-II) был впервые восстанавливали в пробирке Plumley и Шмидта в 1987 году 1. Исследователи экстрагировали очищенная от липидов и пигментов белок отдельно от хлоропластах растений, а затем в сочетании тепловой денатурированного белка с пигментами в присутствии литий додецилсульфата (СПД), а затем с помощью трех циклов замораживания и оттаивания 1. Они показали, что спектральные свойства восстановленного LHC комплексов были очень похожи на комплексов, выделенных из растений. Легкость воссоздания LHC пигмент-белковых комплексов, вероятно, связано с некоторой присущей функцией самосборки, наряду с трудностями в изоляции очищенные комплексы из организмов, привели к быстрому принятию метода другими исследователями. Восстановление фотосинтезирующих белков экспрессия в Escherichia coli (кишечная палочка) было достигнуто Полсен и коллегами в 1990 году 6. У Е.палочки, сверхэкспрессированный мембранные белки, как правило, содержится в телец включения, какие объекты их очистки. Восстановление достигается за счет тепловой денатурации из телец включений, содержащих рекомбинантный белок в присутствии LDS, с последующим добавлением пигментов который инициирует свертывание белка. Складные из LHCII комплекса состоит из двух этапов: первый, хлорофилл связан менее чем за 1 мин; Второй, хлорофилл б связан и стабилизируется в течение нескольких минут 7.
В дополнение к предоставлению понимание динамики складных, в пробирке восстановления в сочетании с сайт-направленного мутагенеза позволило выявить специфических аминокислот, важных для стабильности (например, 8,9) или координации пигмента (например, 10). Манипуляция рефолдинга условия от регулировки таких параметров, как пигментного состава или моющих средств также определили элементы Criticaл для правильного складывания, например, требование ксантофиллов для LHCII комплекса (например, 1,11). Кроме того, исследование свойств отдельных пигментов, связанных с комплексов стало возможным с помощью комплексов восстанавливают в естественных условиях (например, 10).
Метод, описанный здесь начинается с выделения пигментов (хлорофиллов и каротиноидов) из шпината и зеленой водоросли Chlamydomonas reinhardtii. Выражение и очистки LHC белка из Е. палочка в форме телец включения затем подробно, с последующим восстановлением из LHC и последующей очистки методом аффинной колонке Ni. На конечной стадии, восстановленные комплексы дополнительно очищали центрифугированием в градиенте сахарозы, чтобы удалить свободные пигменты и развернутую апобелка. Этот протокол представляет собой оптимизированный процедуру, включающую несколько модификаций, которые были введены различными лабораториями болееВремя 1,6,10,12 -14.
Мембранные белки не так легко учиться. Выделение нативных белков мембран затруднено необходимостью для растворения липидный бислой с моющими средствами, которые могут повредить белок и удалить основные кофакторов. Эти белки также могут присутствовать на низком уровне в биологических мембранах, или смешивать с тесно связанных белков, как и в случае с легкими комплексов заготовки, что делает очистку отдельных комплексов сложных. Гетерологическая экспрессии белка в E. палочка и в пробирке восстановления дает возможность избежать этих проблем. В пробирке восстановление и очистка свернутых белков приводит к комплексам, которые обладают характеристиками, очень похожие на те, из нативных комплексов 20,21,23 и, следовательно, может быть использован для изучения комплексов, которые не могут быть очищены до гомогенности 24 – 27.
Этот метод использует шпинат, который легко attainabле круглый год, в качестве источника для общего пигментных и каротиноидов препаратов. Для некоторых reconstitutions белков родных к морским водорослям, использование пигментов, выделенных из водорослей является предпочтительным в силу различных композиций пигмента. КХЛ соотношение / б и Хл отношение / автомобиль остается тем же, независимо от источника пигмента.
Важно понимать, что эффективность восстановления, как правило, около 35% 28. При этом необходимо, чтобы удалить не связанный пигменты и развернутую апопротеина из раствора после восстановления. Протокол очистки двухступенчатый представлена в этом протоколе (см также приводит). Тем не менее, следует отметить, что ступенчатый градиент сахарозы не допускает полное разделение апо- и голо-белка. Для большинства анализов, это не является проблемой, так как апопротеин не содержит пигментов и, таким образом, не мешает функциональных измерений. Тем не менее, в случае, если необходимо полностью удалить апопротеина от фрдействия, содержащий восстановленный комплекс (например, для расчета пигмент к белковой стехиометрии), анионные обменная колонна может использоваться (см Passarini др., 2009 29 для более подробной информации).
Способность сложите рекомбинантных белков свет уборки с изолированными пигментов в пробирке дает возможность "манипулировать" комплексы, изменив реконституции «окружение» различными способами, изменяя тем самым характеристики полученного комплекса. Например, изменение состава пигмента во время восстановления может привести в комплексе с измененной композиции пигмента. Эта функция может быть использована для изучения влияния различных пигментов на структуру и стабильность комплекса. Обычно подготовка пигментом, полученным из шпината имеет A / B соотношение Хл 3: 1 и / автомобиль соотношение Хл 2,9: 1. Это отношение обычно производит восстановленный белок с теми же свойствами, что и птельной один. Тем не менее, регулировка отношение A / B Chl при добавлении очищенной Chl А или В могут влиять на связывание различных пигментов в связи с изменением селективности сайтов связывания 30 – 33. Это возможно потому, что большинство пигментов сайтов связывания не полностью селективным в отношении Chl A или B Chl, но совместимо с обоими, хотя и с различной аффинностью 10,30,34. Аналогичным образом, сайты связывания каротиноидов также показали, чтобы иметь возможность разместить более одного вида ксантофилл 8,35 – 38. Различные reconstitutions из CP26, другой пигмент-белкового комплекса высших растений, с использованием различных композиций пигментов приведены в таблице 2 39. Эти reconstitutions были использованы для оценки сродства связывающих сайтов для конкретных пигментов 39. Интересно отметить, что для того, чтобы получить комплекс с тем же пигментом сomposition как нативной, отношение Chl A / B из смеси пигмента должно быть 3: 1. Это, кажется, место для всех LHC комплексов высших растений 20,40.
Сочетание молекулярной биологии с техникой реконституции позволяет свойства Хл-связывающего комплекса, который будет изучаться более подробно. Важность различных белковых доменов на стабильность и складывания комплексов или их участие в белок-белковых взаимодействий, были определены путем усечения апопротеина или выполнение случайного мутагенеза 8,41 – 44. Остатки одной аминокислоты, важные для координации различных пигментов может быть изменено с помощью сайт-направленного мутагенеза для анализа свойств отдельных пигментов или оценить их вклад в функции и устойчивости комплексной 10,28,29,45 – 52. На рисунке 6 показан восстановленный Lhcb4 (CP29) смутация гистидин в положении 216 53. Сравнение пигментного состава дикого типа и мутантных комплексов показывает, что мутация вызывает потерю одного Хл молекула, указывая, что целевой сайт размещает Хл в комплексе WT. Различия спектров поглощения WT и мутанта, на нормализации к содержанию пигмента, также показывает, поглощающие свойства утраченного пигмента. В этом случае, разница можно увидеть в главном пика при 680 нм, что свидетельствует о КХЛ координируется His216 поглощает на этой длине волны (для более подробной информации об этом мутанта и спектроскопические свойства см Mozzo др. 2008 53). Анализ мутаций также может быть использован для определения влияния окружающей среды на спектроскопических свойств пигментов 54.
В заключение, легкие белки уборки легко могут быть восстановлены в пробирке в результате пигмента-Proteiп комплексы с очень похожими свойствами в родных комплексов. Таким образом, трудности выделения нативных белков устранены, в то же время обеспечивая белковый препарат с высоким выходом и чистотой для дальнейшего исследования. Важность соотношении 3: 1 Хл а / б в производстве аутентичный комплекс подчеркивается, и примеры восстановленного дикого типа и мутантных ВД приведены для иллюстрации применения техники.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
HisTrap HP | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
Nylon cloth | 20 μm pores | ||
Soft artists paint brush | |||
NONIDET P-40 | Sigma | 74385 | |
Beta-DM | Sigma | D4641 | |
DNAase | ThermoScientific | EN0525 | |
Milk Powders | |||
RNAase | ThermoScientific | EN0531 | |
Sonicator | |||
Octyl β-D-glucopyranoside | Sigma | O8001 | |
Ultracentrifuge XL | Beckman-Coulter | ||
TAP medium | see reference 17 | ||
LB medium | see reference 19 |