This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.
Nas plantas e algas verdes, a luz é capturado pelos complexos absorvedores da luz (CLS), uma família de proteínas de membrana integrais que coordenam clorofilas e carotenóides. In vivo, estas proteínas são dobradas com pigmentos para formar complexos que são inseridas na membrana de tilacoide do cloroplasto. A alta similaridade nas propriedades químicas e físicas dos membros da família, junto com o fato de que eles podem facilmente perder pigmentos durante o isolamento, faz sua purificação em estado nativo desafiador. Uma abordagem alternativa para a obtenção de preparações homogéneas de CLS foi desenvolvido por Plumley e Schmidt em 1987 1, que demonstraram que era possível reconstituir estes complexos in vitro, a partir de pigmentos de apoproteínas purificadas e desdobradas, resultando em complexos com propriedades muito semelhantes às do nativa complexos. Isto abriu o caminho para a utilização de proteínas recombinantes expressas bacterianas in vitro </em> reconstituição. O método de reconstituição é poderosa por várias razões: (1) preparações de complexos puros individuais podem ser obtidos, (2) a composição de pigmento pode ser controlado para avaliar a sua contribuição para a estrutura e função, (3) as proteínas recombinantes podem ser mutados para estudar o funcional papel dos resíduos individuais (por exemplo, locais de ligação de pigmento) ou domínio da proteína (por exemplo, a interacção proteína-proteína, dobragem). Este método foi optimizado em vários laboratórios e aplicada à maior parte dos complexos de luz-colheita. O protocolo descrito aqui detalha o método de reconstituição de complexos de luz-colheita in vitro atualmente utilizados em nosso laboratório, e exemplos que descrevem aplicações do método são fornecidos.
O aparato fotossintético das plantas e algas incluem proteínas integrais de membrana que se ligam clorofila a (chl a), b (chl b) e carotenóides (carro). Estes complexos proteína-pigmento são ativos na captação de energia luz e transferir essa energia de excitação para os centros de reação, onde é usado para promover a separação de carga 2. Eles também estão envolvidos em mecanismos de feedback reguladoras que protegem o aparato fotossintético contra danos luz alta 3,4. Os complexos de colheita de luz (CLS) são constituídos por uma grande família de proteínas relacionadas de plantas e algas 5.
A purificação homogênea de cada membro da família tem sido complicada pelas propriedades químicas e físicas muito semelhantes dos complexos. Além disso, os procedimentos de purificação, muitas vezes resultam em perda de pigmentos ou de outros co-factores potenciais, tais como lípidos. In vitro represen reconstituiçãots um poderoso método para ultrapassar estes problemas. O LHC associada com fotossistema II (LHC-II) foi reconstituído primeiro in vitro por Plumley e Schmidt em 1987 1. Os investigadores proteína extraída delipidado e pigmentos separadamente a partir de cloroplastos de plantas e, em seguida, combinada a proteína desnaturada com calor pigmentos na presença de lítio dodecilsulfato (LDS), seguido por três ciclos de congelamento e descongelamento 1. Eles demonstraram que as propriedades espectrais dos complexos reconstituídos LHC foram muito semelhantes para os complexos purificados a partir de plantas. A facilidade de reconstituição de complexos proteína-pigmento LHC, provavelmente devido a alguma característica de auto-montagem inerente, juntamente com a dificuldade de isolar complexos purificados a partir de organismos, levou à rápida adoção do método por outros pesquisadores. A reconstituição de proteínas fotossintéticas expresso em Escherichia coli (E. coli) foi obtida por Paulsen e colegas em 1990 6. Em E.coli, as proteínas da membrana sobreexpressos são normalmente contidos em corpos de inclusão, que as respectivas instalações de purificação. A reconstituição é conseguido através de desnaturação térmica dos corpos de inclusão contendo a proteína recombinante na presença de LDS, seguido pela adição de pigmentos, que inicia o enrolamento de proteínas. Dobragem do complexo LHCII é um processo de dois passos: primeiro, a clorofila é ligado em menos de 1 min; segundo, a clorofila b é obrigado e estabilizado ao longo de vários minutos 7.
Além de proporcionar uma visão da dinâmica de dobragem, na reconstituição in vitro combinada com mutagénese dirigida para o local permitiu a identificação de aminoácidos específicos importantes para a estabilidade (por exemplo, 8,9) ou a coordenação de pigmento (por exemplo, 10). Manipulação de redobramento condições de ajustar os parâmetros tais como a composição pigmento ou detergentes também identificaram elementos critical para a dobragem adequada, tais como a exigência de Xantofilas para o complexo LHCII (por exemplo, 1,11). Além disso, a investigação das propriedades de pigmentos individuais ligados aos complexos foi possível utilizando complexos reconstituídos in vivo (por exemplo, 10).
O método descrito aqui começa com o isolamento de pigmentos (clorofilas e carotenóides) a partir de espinafres e a alga verde Chlamydomonas reinhardtii. A expressão e purificação de uma proteína a partir de E. LHC coli na forma de corpos de inclusão é então descrito, seguindo-se a reconstituição de LHC e subsequente purificação por coluna de afinidade com Ni. No último passo, os complexos reconstituídos são ainda purificado por centrifugação em gradiente de sacarose para remover pigmentos livres e apoproteína desdobrado. Este protocolo representa um procedimento otimizado incorporando várias modificações que foram introduzidas por diferentes laboratórios maistempo 1,6,10,12 -14.
As proteínas da membrana não são tão fáceis de estudar. O isolamento de proteínas de membrana nativa é complicado pela necessidade de solubilizar a bicamada lipídica com detergentes, o que pode danificar a proteína e remover cofactores essenciais. Estas proteínas também pode estar presente em níveis baixos em membranas biológicas, ou ser misturado com as proteínas intimamente relacionadas, como no caso dos complexos de colheita de luz, que faz com que a purificação dos complexos individuais difíceis. Expressão de proteínas heterólogas em E. coli e na reconstituição in vitro oferece a possibilidade de evitar estes problemas. in vitro reconstituição e purificação de proteínas dobradas resultados em complexos que possuem características muito semelhantes às dos complexos nativos 20,21,23 e, portanto, pode ser usado para estudar os complexos que não podem ser purificados até à homogeneidade 24 – 27.
Este método utiliza o espinafre, a qual é facilmente attainable durante todo o ano, como uma fonte para o pigmento e carotenóides totais preparativos. Para algumas reconstituições de proteínas nativas em algas, a utilização de pigmentos purificados a partir de algas é preferido devido a diferentes composições de pigmento. O a / b razão Chl e relação / carro Chl permanece a mesma, independentemente da fonte de pigmento.
É importante perceber que a eficiência da reconstituição é geralmente cerca de 35% 28. Assim, é necessário remover os pigmentos não-ligados e a apoproteína desdobrado a partir da solução depois da reconstituição. Um protocolo de purificação de dois passos é apresentado neste protocolo (ver também os resultados). No entanto, deve notar-se que o passo do gradiente de sacarose não permite a separação completa de apo e holo-proteína. Para a maioria das análises isto não é um problema, a apoproteína, como não contêm pigmentos e, portanto, não interferem com as medições funcionais. No entanto, no caso de ser necessário remover completamente a apoproteína do fração contendo o complexo reconstituído (por exemplo, para calcular o pigmento a estequiometria de proteína), uma coluna de permuta aniónica podem ser utilizados (ver Passarini et al. 2009 29 para detalhes).
A capacidade para redobrar proteínas recombinantes de colheita de luz, com pigmentos isoladas in vitro, oferece a oportunidade de "manipular" os complexos modificando a reconstituição "ambiente" de vários modos, alterando assim as características do complexo resultante. Por exemplo, alterando a composição do pigmento durante a reconstituição pode resultar em um complexo com a composição de pigmento alterada. Esta característica pode ser utilizada para estudar a influência vários pigmentos têm sobre a estrutura e a estabilidade do complexo. Normalmente, a preparação do pigmento obtido de espinafre tem um a / b clorofila proporção de 3: 1 e uma proporção / chl carro de 2,9: 1. Este rácio tipicamente produz uma proteína reconstituída com as mesmas propriedades que o nAtive um. No entanto, o ajuste de um a / b clorofila proporção pela adição de uma purificado Chl ou b podem influenciar a ligação de diferentes pigmentos, devido à variação de selectividade dos locais de ligação de 30-33. Isto é possível porque a maior parte dos locais de ligação de pigmentos não são completamente selectivas para clorofila a ou clorofila b, mas pode acomodar ambos, embora com diferente afinidade 10,30,34. De um modo semelhante, os locais de ligação de carotenóides, também foram exibidas para ser capaz de acomodar mais do que uma espécie de xantofila 8,35 – 38. Diferentes reconstituições de CP26, outro complexo pigmento-proteína de plantas superiores, usando várias composições de pigmento estão apresentados na Tabela 2 39. Estas reconstituições foram usadas para avaliar a afinidade dos sítios de ligação específicos de pigmentos 39. É interessante notar que a fim de obter um complexo com o mesmo pigmento composição como uma nativa, a clorofila a relação a / b da mistura de pigmentos deve ser de 3: 1. Este parece ser o caso para todos os complexos do LHC de plantas superiores 20,40.
A combinação de biologia molecular, com a técnica de reconstituição permite que as propriedades de um complexo de ligação a clorofila a ser estudado em mais detalhe. A importância dos diferentes domínios de proteínas na estabilidade e dobramento dos complexos, ou o seu envolvimento nas interações proteína-proteína, foram determinados por truncar a apoproteína ou realizar mutagênese aleatória 8,41 – 44. Resíduos de aminoácidos standard importantes para a coordenação das diferentes pigmentos pode ser alterado através de mutagénese dirigida ao local, de modo a analisar as propriedades de pigmentos individuais ou avaliar a sua contribuição para a função e estabilidade do complexo de 10,28,29,45 – 52. Figura 6 mostra reconstituído Lhcb4 (CP29) comuma mutação da histidina na posição 216 53. Uma comparação da composição de pigmento de tipo selvagem e mutantes de complexos indica que a mutação induz a perda de uma molécula de clorofila a, indicando que o sítio alvo acomoda um um Chl no complexo WT. As diferenças do espectro de absorção de WT e mutantes, mediante a normalização para o teor de pigmentos, também mostra as propriedades de absorção do pigmento perdido. Neste caso, a diferença pode ser visto no pico principal a 680 nm, o que indica que a clorofila a coordenada por His216 absorve a este comprimento de onda (para mais detalhes sobre este mutante e as propriedades espectroscópicas ver Mozzo et al. 2,008 53). Análise de mutação também pode ser utilizado para determinar o efeito do ambiente nas propriedades espectroscópicas dos pigmentos 54.
Em conclusão, as proteínas de colheita de luz pode facilmente ser reconstituída in vitro, resultando em pigmento-protein complexos com propriedades muito semelhantes aos complexos nativos. Deste modo, as dificuldades de isolamento de proteínas nativas são eliminados, ao mesmo tempo, proporcionando a preparação de proteínas com elevado rendimento e grau de pureza para mais estudos. A importância de uma proporção 3: a / b clorofila 1 na produção de um complexo autêntico é enfatizado, e exemplos de tipo selvagem reconstituído e CLS mutantes são fornecidos para ilustrar as aplicações da técnica.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
HisTrap HP | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
Nylon cloth | 20 μm pores | ||
Soft artists paint brush | |||
NONIDET P-40 | Sigma | 74385 | |
Beta-DM | Sigma | D4641 | |
DNAase | ThermoScientific | EN0525 | |
Milk Powders | |||
RNAase | ThermoScientific | EN0531 | |
Sonicator | |||
Octyl β-D-glucopyranoside | Sigma | O8001 | |
Ultracentrifuge XL | Beckman-Coulter | ||
TAP medium | see reference 17 | ||
LB medium | see reference 19 |