במבחנת כינונה מחדש של מכלולי אור קציר של צמחים ואצות ירוקות

.1 סך פיגמנט הפקה מעליי תרד Homogenize קומץ אחד של עליי תרד (~ 20 ז) בקור גריסה מאגר 100 מ"ל (ראה טבלה 1), תוך שימוש בבלנדר ל20 שניות. סנן את הפתרון באמצעות שתי שכבות של בד ניילון עם נקבוביות בקוטר של 20 מיקרומטר ו צנטריפוגות התסנין ב1,500 XG 10 דקות ב 4 ° C.. Resuspend גלולה המכילה כלורופלסטים עם אמנים רכים לצייר מברשת ב 1 מ"ל של קרה לשטוף הצפת (ראה טבלה 1). ברגע שהגלולה היא resuspended, להוסיף 50 מ"ל של הצפת לשטוף צנטריפוגות הפתרון ב 10,000 XG 10 דקות ב 4 ° C.. הסר את supernatant והעדינות resuspend גלולה (thylakoids) ב50 מ"ל של הצפת לשטוף (ראה טבלה 1). צנטריפוגה הפתרון ב 10,000 XG 10 דקות ב 4 ° C ולהסיר את supernatant לחלוטין. בשלב זה, לבצע את השלבים הבאים בחושך, כדי למנוע חמצון פיגמנט. </li> להוסיף ~ 20 מ"ל של אצטון 80% שנאגרו עם Na 2 CO 3 (ראה טבלה 1) כדי לחלץ את הפיגמנטים. השאר את הפתרון על קרח עבור 10 דקות, vortexing מדי פעם. גלולה המרכיבים התאיים על ידי צנטריפוגה XG ב 12,000 ל15 דקות ב 4 ° C.. הערה: אם פיגמנטים לא לגמרי חילוץ, גלולה תהיה צבע ירוק וצעד 1.6 יש לחזור. לאסוף את supernatant לתוך משפך separatory. הוספת 0.4 כרכים של diethylether, לנער במרץ ולפתוח את השסתום לפרוק את הגז. הוספת 0.8 כרכים של 0.33 M NaCl וערבב במרץ. לאפשר 10 דקות ~ לשכבות להפריד. שלב האתר על גבי מכיל פיגמנטים שחולצו. הסר את השלב נמוך יותר ברור. הערה: אם ההפרדה אינה ברורה, להקפיא ולהפשיר את הפתרון כדי לשפר את ההפרדה פאזות. הסר את האתר על ידי שפיכתו מחלק העליון של משפך separatory לתוך מיכל זכוכית מתאים. יבש על ידי הוספת כפית של גראןנתרן גופרתי נטול מים ular. לערבל את הפתרון ולאפשר ~ 5 דקות לתבושו לספוג מים מהאתר. הערה: חזור על שלב זה אם נתרן גופרתי מופיע בכבדות לחלוטין יחד; לא צריך להיות כמה גבישי ריחוף ללא כאשר האתר הוא מיובש מספיק. אם טפסי שכבת מים, להסיר את זה עם pipet פסטר לפני הוספת נתרן גופרתי נטול מים נוספים. למזוג האתר למכל זכוכית חדש, שעזב את נתרן גופרתי מוצק מאחורי. להתאדות האתר בspeedvac סיבובי או תחת זרם של N 2. ממיסים את הפיגמנטים לחלוטין ב10 מ"ל של אצטון 100%. לדלל כמות קטנה (~ 3 μl) ל1 מ"ל של 80 אצטון% ולמדוד את ספקטרום הקליטה ולקבוע / שיעור כלורופיל b וריכוז Chl עם השיטה המתוארת על ידי et Porra אל. (1989) 15. Aliquot ולייבש את הפיגמנטים בspeedvac סיבובי או תחת N זרם 2 עד אצטון הואהתאדה לחלוטין. אחסן את הפיגמנטים היבשים ב -80 מעלות צלזיוס. 2 הפקה של הקרוטנואידים מתרד בצע את פעולות 1.1-1.5. בשלב זה, לבצע את השלבים הבאים בחושך, כדי למנוע חמצון פיגמנט. Resuspend גלולה thylakoid ב~ אתנול 50 מ"ל 96% שנאגרו עם Na 2 CO 3 (ראה טבלה 1) כדי לחלץ את הפיגמנטים. השאר את הפתרון על קרח למשך 5 דקות. גלולה המרכיבים התאיים על ידי צנטריפוגה XG ב 12,000 ל15 דקות ב 4 ° C.. הערה: אם פיגמנטים לא לגמרי חילוץ, גלולה תהיה צבע ירוק וצעד 2.2 יש לחזור. לאסוף את supernatant ולהוסיף 0.1 נפח של 80% KOH (w / v) ליזום סבון. השאר את הפתרון על 4 מעלות CO / N, תרים בחוזקה ומוגן מפני האור. לאסוף את הפתרון לתוך משפך separatory. הוסף 1 נפח של אתר diethyl ומערבבים בעדינות. הוספת 0.8 כרךumes של 0.33 M NaCl ומערבבים בעדינות. לאפשר 10 דקות ~ לשכבות להפריד. שלב אתר התפוז על גבי מכיל קרוטנואידים saponified. הסר את השלב התחתון הירוק על ידי ניקוז דרך ברזלים של המשפך. הוסף 3 כרכים של מים ומערבבים בעדינות כדי להסיר את אשלגן הידרוקסידי. לאפשר השכבות להפריד. הערה: במידה והשלב העליון מופיע מעונן, להוסיף כמות קטנה של NaCl (למשל, 3 גרם של NaCl ב200 מ"ל של תמיסה) ולערבל בעדינות כדי לפזר. הסר את השלב נמוך יותר בניקוז דרך ברזלים של המשפך. בצעו את הפעולות 1.10-1.13. לדלל כמות קטנה (~ 3 μl) ל1 מ"ל של 80 אצטון% ולמדוד את ספקטרום הקליטה ב440 ננומטר באצטון 80%. כדי לקבוע את הריכוז, להשתמש בהכחדה מקדם הממוצעת לקרוטנואידים (ε 440 = 255) 16 בנוסחא הבאה: רכב [מ"ג / מ"ל] = x 11 (נתיב אופטי) (440 ננומטר / 225 שרירי הבטן) = 1 סנטימטר. Aliquot ולייבש את carotenoids בspeedvac או תחת N 2 זרם עד שכל diethylether כבר התאדה. אחסן את הפיגמנטים היבשים ב -80 מעלות צלזיוס. .3 סה"כ פיגמנט וקרוטנואידים הפקה מChlamydomonas reinhardtii לגדול ג reinhardtii על מדיום TAP מוצק 17 בצלחת פטרי על ידי הפצת כמות קטנה של תרבות הנוזלית על פני השטח. לגדול תחת שטף תאורה הרציף של 20 μmol מ -2 שניות PSA תמונות -1 עד שכבה ירוקה של תאים גלויה. באמצעות לולאת inoculating סטרילי, לקצור כמות קטנה של ג reinhardtii ממדיום TAP המוצק ולשים את התאים לתוך 500 מ"ל של מדיום TAP 17 בבקבוק 1 ליטר. לגדול התרבות ב25 C ° עם 170 תסיסה סל"ד תחת שטף תאורה רציף של 20 μmol תמונות מ -2 שניות PSA -1. אחרי 5-6 ימים, התרבות צריכה להגיע לסוף של שלב לוגריתמים (6 x 10 6 תאים / מ"לאו 2-2.5 צפיפות אופטית ב 750 ננומטר). צנטריפוגה התרבות ב4,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C.. לכלל מיצוי פיגמנט, בצע את פעולות 1.6-1.15. התשואה בסך הכל תמצית פיגמנט החל מ500 מ"ל של תרבות צמיחה מלאה של ג reinhardtii הוא סביב 5 מ"ל של תמיסה בריכוז של 0.5 CHL מ"ג + b / מ"ל. להפקת קרוטנואידים, בצע את פעולות 2.2-2.12. .4 טיהור של גופי הכללה לשכפל את רצף הקידוד של חלבון LHC עניין לתוך וקטור ביטוי שתוצאתו תג C-מסוף התמזג באמצעות נהלי ביולוגיה מולקולריים סטנדרטיים. להפוך מבנה זה לE. זן coli מארח כגון BL21 (DE3). הכן תמוגה חיץ, חיץ דטרגנט, חיץ טריטון, TE (טבלת 1), 1 M איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) ובינוני LB 18 עם האנטיביוטיקה המתאימה. פיק singlהדואר E. המושבה coli המכילה שיבוט הביטוי מצלחת טרי מפוספסת ל~ 5 מ"ל של מדיום LB עם האנטיביוטיקה המתאימה באמצעות נהלים סטנדרטיים 6. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה 220 סל"ד לפחות 16 שעות. הוסף 2.5 מ"ל של O / תרבות N לתוך בקבוק 1 ליטר Erlenmeyer עם 250 מ"ל של LB בתוספת האנטיביוטיקה המתאימה. לגדול התאים ל2-3 שעה (או עד OD 600 הוא ~ 0.6) על 37 מעלות צלזיוס ב220 סל"ד. הוספת IPTG לריכוז סופי של 1 מ"מ. תמשיך לגדול תאים על 37 מעלות צלזיוס עם 220 סל"ד 3-4 שעות. צנטריפוגה התרבות 10 דקות ב XG 5,000 על 4 מעלות צלזיוס בצינור צנטריפוגות-שקל מראש. בטל supernatant ביסודיות ולקבוע את המשקל את הכדור על ידי שקילה שוב והפחתת משקל צינור צנטריפוגות. Resuspend E. תא גלולה coli ב0.8 מ"ל / גרם תמוגה חיץ על ידי vortexing הנמרץ. הערה: לחלופין, התא גלולה יכול להיות קפוא ב -80C לשימוש מאוחר יותר. אם מתחיל עם גלולה קפוא, תאפשר להפשיר לחלוטין לפני הוספת מאגר תמוגה. הוסף 2 מ"ג של ליזוזים לגרם של תאים, ולדגור על קרח רטוב עם vortexing מזדמן ל30 דקות. הוסף 20 מיקרוגרם / מ"ל DNAse, 10 מ"מ MgCl 2, 1 mM NaCl, 20 מיקרוגרם / מ"ל RNAse. וורטקס ולשים על קרח למשך 30 דקות. הוסף 2 מ"ל של חיץ דטרגנט הקר לגרם של תאים. מערבבים היטב ולשמור על RT במשך 5 דקות. העברה ל2 צינורות מ"ל צנטריפוגות (התפצלה לשני צינורות במידת צורך). צנטריפוגה ל10 דקות ב 12,000 XG ב 4 ° C עד גלולה גופי ההכללה. הוסף 1 מ"ל של טריטון הקר חיץ וresuspend את הכדור על ידי sonification (3 פולסים 5 שניות כוח x 50% x עם 20 מרווחי שניות) לחלוטין. הערה: יש לי הצינור בכוס קטנה המוקפת במי קרח כדי לשמור אותו קר בsonification. במקרה של צינורות מרובים, לשלב את גופי הכללת resuspended לתוך צינור אחד אחרי resuspension. צנטריפוגה ל10 דקות ב 12,000XG ב 4 ° C עד גלולה גופי ההכללה. חזור על שלב 4.13 ו4.14 שתי פעמים. Resuspend גופי ההכללה ב 1 מ"ל של TE הקר עם sonification לשטיפה סופית כדי להסיר את חיץ טריטון. צנטריפוגה ל10 דקות ב 12,000 XG ב 4 ° C עד גלולה גופי ההכללה. Resuspend גלולה ב 1 מ"ל של TE הקר על ידי sonification. להעריך את ריכוז החלבון בשיטות סטנדרטית כגון assay ברדפורד 19. aliquots חנות של גופי ההכללה ב -20 מעלות צלזיוס. .5 כינונה מחדש פרוטוקול זה בדרך כלל תשואות 1-2 מ"ל של חלבון מחדש עם OD של 4 כאשר הספיגה נמדדה באזור QY (600-750 ננומטר). כמות יכולה להיות מותאמת לפי צורך, אם כי יש להקפיד לשמור על היחסים התקינים במהלך ההליך. הכן את הפתרונות הבאים כפי שמתואר בטבלה 1: 2x הכינון המאגר, 20% OG, 2 M KCl, TE. בצע את ים הבאteps באור עמום. Resuspend 800 מיקרוגרם של גופי הכללת LHC בסך של 400 μl TE בצינור microfuge 2 מ"ל. הוספת 400 μl של 2x הכינון הצפת ובקצרה מערבולת. הוספת 0.6 μl של β-mercaptoethanol (M 14.8 המלאי) יש ריכוז סופי של 10 מ"מ. מחממים את החלבון 1 דקות ב98 מעלות צלזיוס. וורטקס בקצרה מקום ב RT במשך 3 דקות. Resuspend 500 מיקרוגרם בסך הכל פיגמנטים כלורופיל מיובש בתוספת 80 מיקרוגרם פיגמנטים קרוטנואידים ב30 μl 100% EtOH ידי נמרצות vortexing דקות 1 או מקום בsonicator אמבטיה ל1-2 דק '. ספין תערובת פיגמנט ~ 30 שניות ב15,800 XG ב 4 מעלות צלזיוס ולאשר כי אין גלולה. אם יש גלולה, לחזור vortexing ו / או sonification. חשוב: לאחר resuspension והספין, להוסיף מייד פיגמנט לחלבון, או שהוא יכול לצבור ויצטרך להיות מושעה שוב. לאט לאט להוסיף את תערובת פיגמנט לחלבון המקורר תוך vortexing. המשך מערבולת 5-10 שלצינור ec ומניחים על קרח רטוב. היזהר שלא המערבולת מדי במרץ, כאשר החלבון יכול לעלות על גדותיו העליונה של הצינור. הוספת 94 μl של 20% β-D-glucopyranoside Octyl (OG) (ריכוז סופי של 2%), בקצרה מערבולת ולשמור על קרח 10 דקות. הוסף 90 μl של KCl 2 M (ריכוז סופי 150-200 מ"מ), בקצרה מערבולת ולשמור על קרח 20 דקות. הערה: הכנת טור (סעיף 6) יכולה להיות יזם בשלב זה. ספין 10 דקות ב 15,800 XG ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant מבלי להפריע גלולה (זירזה LDS) לצינור 10 מ"ל. שמור על קור ומוגן מפני אור. .6 טיהור טור ניקל הכן את הפתרונות הבאים כפי שמתואר בטבלה 1: חיץ OG, חיץ לשטוף OG, חיץ Elution. חבר עמודה Ni-Sepharose (1 מ"ל) או שווה ערך למשאבת peristaltic להבטיח כי אין אוויר נכנס פנימה הטור בשלב זה והשלבים הבאים. קבע את המהירות של tהוא לשאוב עד 1 מ"ל / דקה ולשטוף את העמודה עם 5-10 מ"ל של מים כדי להסיר את פתרון האחסון. לאזן את העמודה עם 3-4 מ"ל של חיץ OG. להוסיף 3-4 מ"ל של חיץ OG למדגם החלבון והעומס לעמודה. הערה: אם החלבון כבר יושב על קרח ליותר מ 10 דקות לאחר הסרת LDS, ספין שוב ב15,800 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות כדי להסיר כל משקעים LDS נוספים. יש לשטוף את העמודה עם 5 מ"ל של חיץ OG. יש לשטוף את העמודה עם 2 מ"ל של חיץ לשטוף OG. Elute החלבון קשור עם חיץ elution 3 מ"ל. לאסוף elute הירוק המכיל את החלבון מחדש. הערה: זה בדרך כלל על 1 מ"ל בסך הכל. .7 סוכרוז Gradient צנטריפוגה הכן את הפתרונות הבאים כפי שמתואר בטבלה 1: פתרון סוכרוז, 0.06% β-DM, 0.01 M HEPES, pH 7.6. מלא צינורות ultracentrifuge עם תמיסת סוכרוז וההקפאה ב -20 CO ° / o Nr -80 ° C לשעה לפחות 1. הסר את הצינור מהמקפיא ולאפשר להפשיר באין מפריע ב 4 ° C.. הערה: תהליך ההקפאה / הפשרה יוצר שיפוע 0.1 לסוכרוז 1 M. צינור 15 מ"ל בדרך כלל מפשיר בשעה בערך 3. מוציא בזהירות מהחלק העליון באותו נפח כחלק הירוק eluted מעמודת Sepharose ניקל בשלב 6.8. לאחר מכן טען את המדגם מחדש על גבי לאט כדי להימנע מלהפריע לשיפוע. צינורות איזון וספין ב200,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס בultracentrifuge באמצעות הרוטור SW-41 או SW-60 מתנדנד דלי ל18 שעה, שנקבע כדי להאט האצה ועצירה ללא בלמים. להוציא בזהירות את השיפוע ממחזיק הצינור עם מלקחיים. השתמש במזרק עם מחט ארוכה שיש לה פתיחה בוטה כדי לאסוף את החלק יחסי מהחלק העליון. הערה: לחלופין, לאסוף שברים מהתחתית על ידי פירסינג הצינור עם מחט ואיסוף טיפות.