在植物和绿藻的捕光配合体外重组

1，总色素的提取菠菜叶均质化1一把菠菜叶（约20克）在100毫升冷水研磨缓冲液的使用混合器，持续20秒（ 见表1）。 筛选通过尼龙布的两层的溶液用20微米和离心机滤液中的气孔直径为1,500 xg离心4℃10分钟。 重悬含有用软艺术家叶绿体沉淀涂料刷在1ml冷洗涤缓冲液（ 见表1）。一旦沉淀物再悬浮，在4℃下加入50mL洗涤缓冲液和离心的溶液以10,000×g离心10分钟。 除去上清液，并轻轻悬浮在50ml洗涤缓冲液的粒料（囊体）（ 见表1）。 离心机在4℃下将溶液以10,000 xg离心10分钟，完全除去上清液。在这一点上，进行在黑暗中执行以下步骤，以避免颜料氧化。 </LI> 加入〜20毫升80％丙酮缓冲用Na 2 CO 3（ 见表1）以提取颜料。留在冰液10分钟，偶尔涡旋。 沉淀的细胞成分通过离心，12,000 xg离心15分钟，在4℃下。 注意：如果颜料不完全提取，沉淀都会有绿色和步骤1.6应重复。 收集上清液到分液漏斗中。添加0.4体积乙醚，剧烈震荡并打开阀门泄了气。 加入0.8倍体积的0.33 M氯化钠和剧烈混合。允许〜10分钟的层分离。在上面的醚相包含所提取的颜料。取下透明的较低阶段。 请注意：如果分离是不明确的，冻结和解冻的溶液，以改善相分离。 从分液漏斗顶部倒出到一个合适的玻璃容器中移除醚。干，加入大一勺ular无水硫酸钠。摇动溶液，并允许〜5分钟，使干燥剂，从乙醚中吸收水分。 注意：重​​复此步骤，如果硫酸钠的出现彻底成群在一起;应该有一定的自由浮动的结晶，当醚充分干燥。如果水层的形式，增加额外的无水硫酸钠前，用巴斯德吸管删除此。 倒出醚，以一个新的玻璃容器中，在离开硫酸钠固体的后面。 蒸发乙醚在旋转SpeedVac中或在N个2流。 在10毫升100％丙酮中完全溶解色素。 稀释少量（〜3微升）在1ml 80％的丙酮中，并测量吸收光谱并确定叶绿素a / b比值，并与由Porra 等人所述的方法中的叶绿素浓度。 （1989）15。 等分试样并干燥在旋转SpeedVac中或在N 2流中的颜料，直至丙酮是完全蒸发。储存干颜料在-80℃。 2，提取类胡萝卜素的菠菜按照步骤1.1〜1.5。在这一点上，进行在黑暗中执行以下步骤，以避免颜料氧化。 重悬在〜50毫升96％乙醇的缓冲用Na 2 CO 3（ 见表1），提取该色素的类囊体颗粒。留在冰上的溶液中5分钟。 沉淀的细胞成分通过离心，12,000 xg离心15分钟，在4℃下。 注意：如果颜料不完全提取，沉淀都会有绿色和步骤2.2应重复。 收集上清液，加入0.1体积的80％的KOH（重量/体积），以引发皂化反应。 离开该溶液在4℃的CO / N，盖紧，并从光保护。 收集的溶液放入分液漏斗中。加入1倍体积的乙醚，轻轻混匀。 添加0.8体积0.33 M氯化钠超微电极，轻轻混匀。允许〜10分钟的层分离。在上面的橙色醚相含有皂化的类胡萝卜素。通过漏斗的旋塞阀排水除去绿色下层相。 加入3倍体积的水，轻轻混匀，以除去氢氧化钾。让各层分开。注意：如果上期出现浑浊，氯化钠加入少量（ 如 3克氯化钠200毫升的溶液），轻轻摇晃溶解。 通过漏斗的旋塞阀排水除去下层相。 按照步骤1.10至1.13。 稀释少量（〜3微升）在1ml 80％的丙酮中，并测量吸收光谱在80％丙酮440纳米。以确定的浓度，使用平均系数灭绝的类胡萝卜素（ε440 = 255）16，在下面的公式：车载[毫克/毫升] =（绝对440纳米 / 225）×11（光路）= 1厘米。 分装和干燥carotenoiDS在SpeedVac中或在氮气流中，直到所有的乙醚被蒸发。储存干颜料在-80℃。 3，总色素和类胡萝卜素的提取莱茵衣藻 C.成长通过散布少量液体培养在表面上在培养皿中藻在固体培养基咨询17。 20微摩尔的照片PSA米-2秒的连续光照通量增长-1直到细胞的绿色层是可见的。 用无菌接种环，收获了少量C的藻从固体TAP培养基中，并把该单元到500ml丝锥介质17中的1L烧瓶中。成长的文化，在25℃，170转搅拌20微摩尔的照片PSA米-2秒的连续光照通量-1。 后5-6天，培养物应达到对数生长期结束时（6×10 6个细胞/ ml的或在750纳米2-2.5光密度）。离心文化为4,000×g离心15分钟，在4℃。 总色素的提取，按照步骤1.6至1.15。 总色素提取物500毫升C的充分发展文化，产莱茵衣藻是大约5毫升0.5毫克叶绿素A + B /毫升浓度的溶液。 类胡萝卜素的提取，按照步骤2.2至2.12。 4，净化包涵体克隆感兴趣的LHC蛋白的编码序列插入一个表达载体中使用标准分子生物学程序，结果在一个稠合的C-端His标签。把这种构建到大肠杆菌大肠杆菌宿主菌株如BL21（DE3）。 制备裂解缓冲液，洗涤剂缓冲器，加入Triton缓冲液，TE（ 表1），1M异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）和LB与适当的抗生素的培养基18。 挑上为单ê 大肠杆菌大肠杆菌菌落含有新鲜的划线盘的表达克隆入〜5ml的LB培养基中使用的标准方法6的合适的抗生素。生长于37℃下用220rpm的转速搅拌至少16小时。 添加2.5毫升的O / N培养成1升锥形瓶中，用250毫升的LB辅以适当的抗生素。 生长细胞为2-3小时（或直到OD 600为〜0.6），在37℃下以220rpm。 添加IPTG至1毫米的终浓度。继续以220rpm的转速3-4小时生长的细胞在37℃。 离心培养10分钟，以5,000 XG在4℃下在预先称重的离心管中。彻底弃去上清液，并确定重粒料通过再次称重并减去该离心管重量。 悬浮大肠杆菌大肠杆菌细胞沉淀于0.8ml / g的裂解缓冲液，剧烈涡旋。 注意：可选地，将细胞沉淀可以在-80冻结下以后使用。如果启动了冻颗粒，允许加入裂解液之前完全解冻。 加入2毫克，每克细胞的溶菌酶，并孵育在湿冰偶尔涡旋30分钟。 加入20微克/毫升DNA酶，10毫米氯化镁2，1 mM氯化钠，20微克/毫升RNA酶。涡旋并置于冰上30分钟。 加入2mL每克细胞的冷洗涤剂缓冲。搅拌均匀，保持室温5分钟。 转移至2ml离心管（分成两管，如果需要的话）。离心机以12,000 XG 10分钟，在4℃下沉淀的包含体。 加入1毫升冷的Triton缓冲液和悬浮完全由声波处理的颗粒（3脉冲X 5秒×50％的电力与20秒的间隔）。注：具有管在小烧杯用冰水环绕声处理过程中保持低温。在多重管的情况下，结合的悬浮包涵体成一个管重悬浮后。 离心机以12,000 10分XG在4℃下沉淀的包含体。 重复步骤4.13和4.14两次。 悬浮在1毫升冷的TE与声波处理包涵体作最后的洗涤，除去海卫缓冲区。离心机以12,000 XG 10分钟，在4℃下沉淀的包含体。 悬浮颗粒在1毫升冷的TE通过声波处理。 评估蛋白质浓度通过标准方法如Bradford测定19。在-20℃的包涵体店等分。 5，重组这个协议典型地产生1-2毫升重组蛋白以4的OD时测定吸光度在的Qy区域（600-750纳米）。量可以根据需要调节，虽然应注意，以在手术过程中保持适当的比率。 制备如表1中所述的下列方案：2X重建缓冲液，20％的OG，2米氯化钾，TE中。执行后续的sTEPS在昏暗的光线。 悬浮800微克的LHC的包涵体中共有400μL的TE在2 ml离心管中。加入400μL的2倍重组缓冲区和涡短暂的。 添加0.6μLβ-巯基乙醇（股票14.8米）有10毫米的终浓度。加热该蛋白为在98℃下1分钟。短暂涡旋并置于室温3分钟。 重悬在30微升100％的乙醇500微克总干叶绿素色素加80微克类胡萝卜​​素由剧烈振荡1分钟，或发生在洗澡超声仪1-2分钟。 旋转的颜料组合〜30秒在15,800 XG在4℃下，并确认没有沉淀。如果有一个小球，重复涡旋和/或超声处理。重要：重悬浮和旋转之后，马上添加颜料的蛋白质，或者它可以聚合和需要被再次悬浮。 慢慢地将颜料混合添加到冷却的蛋白质而涡旋。继续涡5到10秒钟EC和地方管湿冰上。要小心，不要涡旋太大力的蛋白质可以溢出管的顶部。 加入94微升20％辛基β-D-吡喃葡糖苷（OG）（终浓度2％），短暂涡旋并保持在冰上10分钟。 加入90微升的氯化钾2米（终浓度为150〜200毫米），轻轻振荡并保持在冰上20分钟。注：列准备（第6节）可以在这个时候启动。 自旋为在15,800 XG 10分钟，在4℃。除去上清液，而不会干扰沉淀（沉淀LDS）到10毫升管。保持冷并避光。 6，镍柱纯化 OG缓冲器，OG漂洗缓冲液，洗脱缓冲液：如表1中所述制备以下的溶液。 镍 – 琼脂糖凝胶柱（1毫升）或等效连接到蠕动泵以确保没有空气进入柱内时本步骤和下面的步骤。 集合T的速度他泵送至1毫升/分钟，冲洗柱，用5-10毫升的水以除去存储解决方案。 平衡用3-4毫升的OG缓冲柱。 加入3-4毫升的OG缓冲器的蛋白质样品并加载到柱上。注意：如果蛋白质已除去LDS后一直坐在冰上超过10分钟，再次旋转在15,800 XG在4℃下1分钟，以去除任何额外的LDS沉淀。 冲洗用5ml OG缓冲柱。 冲洗该柱用2毫升的OG漂洗缓冲液。 洗脱用3毫升的洗脱缓冲液将结合的蛋白质。收集绿色洗脱包含重新构造蛋白质。注意：这是一般在总约1ml。 7，蔗糖密度梯度离心蔗糖溶液，0.06％β-DM，0.01M HEPES，pH值7.6：如表1中所述制备以下的溶液。 填写超速离心机管道，并在-20°股份有限公司/ N澳蔗糖溶液和冻结ř-80℃下放置至少1小时。 从冰箱中取出试管并允许解冻原状，在4℃。注：冷冻/解冻过程产生的梯度从0.1至1M蔗糖。 15毫升管通常解冻约3小时。 从顶部小心的取出相同体积的镍琼脂糖凝胶柱在步骤6.8洗脱的绿色部分。然后加载在上面的重组样品缓慢以避免扰乱梯度。 使用SW-41或SW-60水平转头18小时，设定为慢加速和停止没有刹车平衡管和自旋以200,000 XG在4℃下在超速离心机。 小心地取出从用钳子管托的梯度。用注射器用长针，有一个钝开来收集从顶部的分数。注意：可替换地，通过刺穿管子用针和收集滴收集从底部馏分。