In Vitro Ricostituzione di Complessi Light-raccolta di piante e alghe verdi

1 Totale Pigmento Estrazione da foglie di spinaci Omogeneizzare una manciata di foglie di spinaci (~ 20 g) in 100 ml di freddo Grinding Buffer (vedi Tabella 1) con un frullatore per 20 sec. Filtrare la soluzione attraverso due strati di tessuto di nylon con un diametro dei pori di 20 micron e centrifugare il filtrato a 1.500 xg per 10 min a 4 ° C. Risospendere il pellet contenente i cloroplasti con un morbido artisti pennello di vernice in 1 ml di tampone di lavaggio a freddo (vedi Tabella 1). Una volta che il pellet viene risospeso, aggiungere 50 ml di tampone di lavaggio e centrifugare la soluzione a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e delicatamente risospendere il pellet (tilacoidi) in 50 ml di tampone di lavaggio (vedi Tabella 1). Centrifugare la soluzione a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C e rimuovere completamente il surnatante. A questo punto, eseguire le seguenti operazioni al buio, per evitare l'ossidazione del pigmento. </li> Aggiungi ~ 20 ml di acetone 80% tamponata con Na 2 CO 3 (vedi tabella 1) per estrarre i pigmenti. Lasciare la soluzione in ghiaccio per 10 minuti, vortex di tanto in tanto. Agglomerare le componenti cellulari mediante centrifugazione a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. NOTA: Se i pigmenti non sono completamente estratti, il pellet avrà un colore verde e punto 1.6 deve essere ripetuto. Raccogliere il supernatante in un imbuto separatore. Aggiungere 0,4 volumi di dietiletere, agitare vigorosamente e aprire la valvola di sfogo del gas. Aggiungere 0,8 volumi di 0,33 M NaCl e mescolare energicamente. Consenti ~ 10 min per separare gli strati. La fase eterea sopra contiene i pigmenti estratti. Rimuovere la fase inferiore chiara. NOTA: Se la separazione non è chiara, congelare e scongelare la soluzione per migliorare la separazione di fase. Rimuovere l'etere versandolo dall'alto della imbuto separatore in un contenitore di vetro adatto. Secco con l'aggiunta di un cucchiaio di granlare solfato di sodio anidro. Agitare la soluzione e lasciare ~ 5 min per l'essiccante per assorbire l'acqua dall'etere. NOTA: Ripetere questo passaggio se il solfato di sodio appare completamente raggruppata insieme; ci dovrebbero essere alcuni cristalli liberi di fluttuare quando l'etere è sufficientemente asciugato. Se si forma un velo d'acqua, rimuovere questo con una pipetta Pasteur prima di aggiungere ulteriore solfato di sodio anidro. Decantare l'etere di un nuovo contenitore di vetro, lasciando il solfato di sodio solido dietro. Si evapora l'etere in un speedvac rotativo o sotto flusso di N 2. Sciogliere i pigmenti completamente in 10 ml di acetone 100%. Diluire una piccola quantità (~ 3 ml) in 1 ml di 80% acetone e misurare gli spettri di assorbimento e determinare l'a / b rapporto Chl e la concentrazione di Chl con il metodo descritto da Porra et al. (1989) 15. Aliquota e asciugare i pigmenti in una speedvac rotativo o sotto N 2 fino a quando il flusso di acetone ècompletamente evaporato. Conservare i pigmenti secchi a -80 ° C. 2 Estrazione di carotenoidi da spinaci Seguire i passaggi da 1.1 a 1.5. A questo punto, eseguire le seguenti operazioni al buio, per evitare l'ossidazione del pigmento. Risospendere il pellet tilacoidi in ~ 50 ml di etanolo al 96% tamponata con Na 2 CO 3 (vedi Tabella 1) per estrarre i pigmenti. La soluzione viene lasciata in ghiaccio per 5 min. Agglomerare le componenti cellulari mediante centrifugazione a 12.000 xg per 15 min a 4 ° C. NOTA: Se i pigmenti non sono completamente estratti, il pellet avrà un colore verde e punto 2.2 deve essere ripetuto. Raccogliere il surnatante e aggiungere 0,1 volume del 80% KOH (w / v) per avviare saponificazione. Lasciare la soluzione a 4 ° CO / N, ben chiuso e al riparo dalla luce. Raccogliere la soluzione in un imbuto separatore. Aggiungere 1 volume di etere etilico e mescolare delicatamente. Aggiungere 0,8 volUmes di 0,33 M NaCl e mescolare delicatamente. Consenti ~ 10 min per separare gli strati. La fase eterea arancione sulla parte superiore contiene i carotenoidi saponificati. Rimuovere la fase inferiore verde drenando attraverso il rubinetto dell'imbuto. Aggiungere 3 volumi di acqua e mescolare delicatamente per rimuovere l'idrossido di potassio. Lasciare che gli strati si separino. NOTA: Se la fase superiore appare torbido, aggiungere una piccola quantità di NaCl (ad esempio, 3 g di NaCl in 200 ml di soluzione) e miscelare delicatamente per sciogliere. Rimuovere la fase inferiore di drenaggio attraverso il rubinetto dell'imbuto. Seguire i passaggi da 1,10-1,13. Diluire una piccola quantità (~ 3 ml) in 1 ml di 80% acetone e misurare gli spettri di assorbimento a 440 nm nel 80% acetone. Per determinare la concentrazione, utilizzare l'estinzione media coefficiente per i carotenoidi (ε 440 = 255) 16 nel seguente formula: Auto [mg / ml] = (Abs 440 nm / 225) x 11 (cammino ottico) = 1 cm. Aliquota e asciugare il carotenoids in un speedvac o sotto N 2 torrente fino a quando tutti etere etilico è stato evaporato. Conservare i pigmenti secchi a -80 ° C. 3 Totale pigmento e carotenoide Estrazione da Chlamydomonas reinhardtii Grow C. reinhardtii su terreno solido TAP 17 in una capsula di Petri diffondendo una piccola quantità di coltura liquido sulla superficie. Crescere sotto illuminazione flusso continuo di 20 micromol foto PSA m -2 s -1 fino a uno strato verde di cellule è visibile. Utilizzando un'ansa da inoculo sterile, raccogliere una piccola quantità di C. reinhardtii dal mezzo TAP solida e mettere le cellule in 500 ml di TAP media 17 in un pallone da 1 L. Far crescere la coltura a 25 ° C con 170 giri al minuto, agitando sotto un'illuminazione flusso continuo di 20 micromol foto PSA m -2 s -1. Dopo 5-6 giorni, la cultura dovrebbe raggiungere la fine della fase logaritmica (6 x 10 6 cellule / mlo 2-2,5 densità ottica a 750 nm). Centrifugare la cultura a 4.000 xg per 15 min a 4 ° C. Per l'estrazione totale del pigmento, seguire i passaggi 1,6-1,15. La resa di estratto totale pigmento a partire da 500 ml di coltura piena crescita di C. reinhardtii è di circa 5 ml di soluzione con una concentrazione di 0,5 mg Chl a + b / ml. Per l'estrazione carotenoidi, seguire i passaggi 2,2-2,12. 4 Purificazione di corpi di inclusione Clonare la sequenza codificante della proteina LHC di interesse in un vettore di espressione che si traduce in un C-terminale sua tag fuso utilizzando le procedure di biologia molecolare standard. Trasforma questo costrutto in E. ceppo ospite coli come BL21 (DE3). Preparare il tampone di lisi, tampone detergente, buffer di Triton, TE (Tabella 1), 1 M isopropilici β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) e terreno LB 18 con gli antibiotici appropriati. Scegli una single E. coli colonia contenente il clone di espressione da un piatto appena striato in ~ 5 ml di terreno LB con gli antibiotici appropriati utilizzando le procedure standard 6. Crescere a 37 ° C con 220 rpm agitazione per almeno 16 ore. Aggiungere 2,5 ml di O / N cultura in un pallone da 1 L Erlenmeyer con 250 ml di LB integrate con l'antibiotico appropriato. Crescere le cellule per 2-3 ore (o fino a quando l'OD 600 è ~ 0.6) a 37 ° C a 220 giri al minuto. Aggiungi IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM. Continua a crescere le cellule a 37 ° C con 220 giri 3-4 ore. Centrifugare la coltura per 10 min a 5000 xga 4 ° C in una provetta da centrifuga pre-pesato. Eliminare il supernatante a fondo e determinare il peso del pellet pesando di nuovo e sottraendo il peso provetta da centrifuga. Risospendere il E. pellet di cellule coli in 0,8 ml / g di tampone di lisi nel vortex vigorosa. NOTA: In alternativa, il pellet cellulare può essere congelato a -80C per un uso successivo. Se a partire da un pellet congelato, lasciar scongelare completamente prima di aggiungere il tampone di lisi. Aggiungere 2 mg di lisozima per grammo di cellule, e incubare in ghiaccio con vortex occasionale per 30 min. Aggiungere 20 mg / ml DNAse, 10 mM MgCl 2, 1 mM NaCl, 20 mg / ml RNAsi. Vortex e mettere in ghiaccio per 30 min. Aggiungere 2 ml di tampone detergente a freddo per grammo di cellule. Mescolare bene e tenere RT per 5 min. Trasferimento a 2 ml provette da centrifuga (diviso in due tubi, se necessario). Centrifugare per 10 minuti a 12.000 xg a 4 ° C per far sedimentare i corpi di inclusione. Aggiungere 1 ml di tampone freddo Triton e risospendere completamente il pellet da sonicazione (3 impulsi x 5 sec x 50% di potenza con intervalli di 20 sec). NOTA: Avere il tubo in un piccolo bicchiere circondato da acqua ghiacciata per mantenerlo freddo durante la sonificazione. Nel caso di più tubi, combinare i corpi di inclusione risospeso in una provetta dopo risospensione. Centrifugare per 10 minuti a 12.000xga 4 ° C per far sedimentare i corpi di inclusione. Ripetere il punto 4.13 e 4.14 due volte. Risospendere i corpi di inclusione in 1 ml di freddo TE con sonification per un lavaggio finale per rimuovere il buffer di Triton. Centrifugare per 10 minuti a 12.000 xg a 4 ° C per far sedimentare i corpi di inclusione. Risospendere il pellet in 1 ml di freddo TE di sonificazione. Valutare la concentrazione di proteine ​​con metodi standard come il saggio Bradford 19. Conservare aliquote dei corpi di inclusione a -20 ° C. 5. Ricostituzione Questo protocollo produce tipicamente 1-2 ml di proteine ​​ricostituito con un diametro esterno di 4 quando assorbanza viene misurata nella regione Qy (600-750 nm). Quantità può essere regolata a piacere, anche se occorre prestare attenzione per mantenere i rapporti corretti durante la procedura. Preparare le seguenti soluzioni, come descritto nella Tabella 1: 2x Tampone di ricostituzione, il 20% OG, 2 M KCl, TE. Eseguire il seguente sPTO in penombra. Risospendere 800 mg di corpi di inclusione LHC in un totale di 400 microlitri TE in una provetta per microcentrifuga da 2 ml. Aggiungere 400 ml di tampone di ricostituzione 2x e vortex brevemente. Aggiungere 0,6 ml di β-mercaptoetanolo (archivio 14.8 M) per avere una concentrazione finale di 10 mM. Riscaldare la proteina per 1 min a 98 ° C. Vortex brevemente e posto a temperatura ambiente per 3 min. Risospendere 500 mg del totale dei pigmenti di clorofilla secchi più 80 mg pigmenti carotenoidi in 30 microlitri 100% EtOH vigorosamente vortex per 1 minuto o posto in un bagno sonicatore per 1-2 min. Gira la miscela pigmento ~ 30 sec a 15.800 xg a 4 ° C e verificare che non vi è alcun pellet. Se c'è un pellet, ripetere vortex e / o sonicazione. IMPORTANTE: Dopo la risospensione e centrifuga, aggiungere subito pigmento alla proteina, oppure può aggregare e dovrà essere risospeso di nuovo. Aggiungere lentamente la miscela pigmento alla proteina raffreddato mentre vortex. Continuare a vortice 5-10 sec provetta e collocarla sul ghiaccio bagnato. Fare attenzione a non vortice troppo energicamente come la proteina può traboccare la parte superiore del tubo. Aggiungere 94 ml di 20% Octyl β-D-glucopiranoside (OG) (concentrazione finale 2%), vortice brevemente e tenere su ghiaccio 10 min. Aggiungere 90 ml di KCl 2 M (concentrazione finale 150-200 mM), vortice brevemente e tenere su ghiaccio 20 min. NOTA: Preparazione della colonna (sezione 6) possono essere avviati in questo momento. Spin per 10 min a 15.800 xg a 4 ° C. Rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet (precipitato LDS) in una provetta da 10 ml. Mantenere freddo e al riparo dalla luce. 6 Nickel colonna di purificazione Preparare le seguenti soluzioni, come descritto nella Tabella 1: tampone OG, buffer di risciacquo OG, tampone di eluizione. Collegare una colonna Ni-Sepharose (1 ml) o equivalente ad una pompa peristaltica assicurare che l'aria penetri all'interno della colonna durante questa fase e le seguenti operazioni. Impostare la velocità di tsi pompa a 1 ml / min e risciacquare la colonna con 5-10 ml di acqua per rimuovere la soluzione di archiviazione. Equilibrare la colonna con 3-4 ml di tampone OG. Aggiungere 3-4 ml di tampone OG al campione proteico e carico alla colonna. NOTA: se la proteina è stato seduto sul ghiaccio per più di 10 minuti dopo la rimozione di LDS, girare di nuovo a 15.800 xg a 4 ° C per 1 min per rimuovere qualsiasi precipitazione LDS aggiuntivo. Lavare la colonna con 5 ml di tampone OG. Lavare la colonna con 2 ml di tampone OG risciacquo. Eluire le proteine ​​con 3 ml di tampone di eluizione. Raccogliere il eluire verde che contiene la proteina ricostituita. NOTA: Questo è di solito di circa 1 ml in totale. 7 centrifugazione in gradiente di saccarosio Preparare le seguenti soluzioni, come descritto nella Tabella 1: soluzione di saccarosio, 0,06% β-DM, HEPES 0,01 M, pH 7,6. Riempire i tubi ultracentrifuga con la soluzione di saccarosio e congelare a -20 ° CO / N or -80 ° C per almeno 1 ora. Togliere la provetta dal freezer e lasciare scongelare indisturbati a 4 ° C. NOTA: Il processo di congelamento / scongelamento crea un gradiente 0,1-1 M saccarosio. Un tubo da 15 ml si scioglie di solito in circa 3 ore. Rimuovere con cautela dalla parte superiore lo stesso volume la frazione verde eluito dalla colonna Sepharose nichel al punto 6.8. Poi caricare il campione ricostituito in cima lentamente per evitare di disturbare il gradiente. Saldo tubi e centrifugare a 200.000 xg a 4 ° C in un'ultracentrifuga utilizzando un rotore secchio SW-41 o SW-60 oscillante per 18 ore, impostare a rallentare l'accelerazione e arresto senza freni. Togliere la sfumatura dal supporto tubo con una pinza. Utilizzare una siringa con un ago lungo che ha una apertura smussato per raccogliere la frazione dall'alto. NOTA: In alternativa, raccogliere frazioni dal fondo forando il tubo con un ago e di raccolta gocce.