This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.
植物および緑藻類では、光は光捕集複合体(LHCs)、クロロフィルおよびカロテノイド座標内在性膜タンパク質のファミリーによって捕捉される。 インビボでは 、これらのタンパク質はチラコイド膜に挿入されている複合体を形成する顔料を用いて折り畳まれる葉緑体の。ファミリーのメンバーの化学的および物理的特性の高い類似性は、一緒に彼らは簡単に単離中の顔料を失う可能性があるという事実と、天然の状態での精製が困難なことができます。 LHCsの均質な調製物を得るための別のアプローチは、それが天然のものと非常に類似した特性を有する複合体が得られる、精製された顔料および折り畳まれていないアポタンパク質から出発して、インビトロでこれらの複合体を再構成することが可能であったことを示した1987年1 Plumleyシュミットによって開発された複合体。これは、in vitro細菌発現された組換えタンパク質の使用への道を開い</eM>再構成。再構成方法は、さまざまな理由で強力である:(1)個別の複合体の純粋な調製物を得ることができる、(2)顔料組成物は、構造と機能するようにそれらの寄与を評価するように制御することができる、(3)組換えタンパク質は、機能を研究するために突然変異させることができる個別の残基( 例えば、顔料結合部位)、またはタンパク質ドメイン( 例えば、タンパク質-タンパク質相互作用、フォールディング)の役割。この方法は、いくつかの研究室で最適と光捕集複合体の大部分に適用されている。ここに記載されているプロトコルは、現在、私たちの研究室で使用されるin vitroでの集光性複合体を再構成する方法を詳述 および方法の用途を説明する実施例を提供する。
植物や藻類の光合成装置は、膜内在性(CHL a)のクロロフィル a を結合するタンパク質、B(クロロフィルb)およびカロテノイド(車)が挙げられる。これらの色素-タンパク質複合体は、収穫光エネルギーで活性であり、それが電荷分離2を促進するために使用される反応中心にその励起エネルギーを伝達する。それらはまた、高い光損傷3,4から光合成装置を保護調節フィードバック機構に関与している。集光複 合体(LHCs)は植物や藻類5の関連タンパク質の大きなファミリーで構成されている。
ファミリーの各メンバーの均質な精製は、複合体の高度に類似の化学的及び物理的性質によって複雑化されている。また、精製手順は、しばしば、顔料または脂質などの他の潜在的な補因子の損失をもたらす。 インビトロ再構成representsは強力な方法は、これらの問題を克服する。光化学系II(LHC-II)に関連付けられているLHCは、最初1987年1 Plumleyとシュミットによってin vitroで再構成された。研究者は、植物の葉緑体とは別に脱脂タンパク質及び顔料を抽出した後、リチウムの存在下での顔料と熱変性タンパク質を組み合わせた凍結融解1の3つのサイクルが続くドデシル硫酸(LDS)、。これらは、再構成されたLHC複合体のスペクトル特性は、植物から精製された複合体と非常に類似していたことを示した。何らかの固有の自己組織化機能への可能性が高いLHC顔料 – タンパク質複合体を再構成の容易さは、生物から精製された複合体を単離することが困難であるとともに、他の研究者による方法の迅速な採択につながった。 大腸菌(E. coli)で過剰発現光合成タンパク質の再構成1990年6ポールセンらによって達成された。E.で大腸菌は、過剰発現した膜タンパク質は、典型的には、その設備のそれらの精製、封入体に含まれている。再構成は、タンパク質の折り畳みを開始する顔料を添加したLDSの存在下で組換えタンパク質を含有する封入体の熱変性によって達成される。 LHCII複合体の折り畳みは、2段階のプロセスである:まず、 クロロフィル a が 1分以内に結合している;第二、 クロロフィル b は、数分7かけ結合し、安定化される。
フォールディング動力学への洞察を提供することに加えて、部位特異的突然変異誘発と組み合わせたインビトロでの再構成において安定性( 例えば、8,9)または顔料の調整( 例えば、10)に特異的なアミノ酸の同定が重要で可能にした。そのような顔料組成物または洗剤のようなパラメータを調整することによってリフォールディング条件の操作はまた、要素criticaを同定したそのようなLHCIIコンプレックスのキサントフィルの要件として適切な折り畳みのためのL( 例えば、1,11)。さらに、複合体に結合された個別の顔料の特性の調査は生体内で再構成された複合体を使用可能であった( 例えば、10)。
ここで説明する方法は、ほうれん草と緑藻クラミドモナスから色素(クロロフィルやカロテノイド)を単離することから始まる。EからLHCのタンパク質の発現および精製封入体の形で大腸菌を LHCとNiアフィニティーカラムによるその後の精製の 再構成に続いて、次に詳細に説明する。最後のステップでは、再構成された複合体はさらに自由顔料および折り畳まれていないアポタンパク質を除去するために、スクロース勾配遠心分離により精製される。このプロトコルは、以上の異なる研究所によって導入されたいくつかの変更を組み込んだ最適化された手順を示して時間1,6,10,12 -14。
膜タンパク質は勉強するのは簡単ではありません。天然の膜タンパク質の単離は、タンパク質を損傷し、必須の補因子を除去することができる界面活性剤と脂質二重層を可溶化する必要性によって複雑になる。これらのタンパク質は、集光性複合体の場合のように、それは、単一の複合体の精製が困難になる、また、生体膜において低レベルで存在するかもしれない、または密接に関連するタンパク質と混合する。 E.における異種タンパク質の発現大腸菌およびインビトロでの再構成中 これらの問題を回避する可能性を提供する。従ってネイティブ複合体20,21,23とのものと非常に類似した特性を有する複合体におけるインビトロ再構成および折り畳まれたタンパク質の精製の 結果が均質24にまで精製することができない複合体を研究するために使用することができ– 27。
この方法は簡単にattainabさほうれん草を使用しています全顔料及びカロテノイド調製物のためのソースとしてル一年中、。藻類に対する天然のタンパク質のいくつかの再構成のために、藻類から精製された顔料の使用は、異なる顔料組成物に好適である。クロロフィルa / bの比およびクロロフィル/車比に関係なく、顔料ソースの同じままである。
これは、再構成の効率は通常約35%で28であることを認識することが重要です。したがって、再構成後の溶液から非結合顔料および折り畳まれていないアポタンパク質を除去することが必要である。二段階精製プロトコルは、(また結果を参照)、このプロトコルで提示される。しかし、ショ糖勾配ステップはアポとホロタンパク質の完全な分離を可能にしないことに留意すべきである。アポタンパク質は、機能的測定を妨害しない、したがって顔料を含有しない限り、ほとんどの分析のため、これは問題ではない。しかし、ケースでは、完全に、FRからアポタンパク質を除去することが必要である再構成された複合体(例えば、タンパク質の化学量論に顔料を計算する)を含有するアクションは、陰イオン交換カラムは、(参照Passarini ら詳細については2009年)を使用することができる。
試験管内で孤立した顔料を用いて、組換え集光タンパク質をリフォールディングする能力は、それによって得られた複合体の特性を変化させる、さまざまな方法で再構成「環境」を変更することにより、複合体を「操る」する機会を提供する。例えば、再構成中の顔料組成物を変更すると、変更された顔料組成物との複合体をもたらすことができる。この機能は、各種顔料を複合体の構造および安定性に及ぼす影響を調べるために利用することができる。 1と2.9のクロロフィル/車比:1通常ホウレンソウから得られた顔料調製物は、3のクロロフィルa / bの比を有する。この比率は、一般的にn個と同じ性質を用いて再構成タンパク質を産生する1をative。 33 –しかし、精製されたクロロフィルAまたはBの添加によりクロロフィルa / bの比の調整は、結合部位30の選択性を変化させることに起因する異なる顔料の結合に影響を与えることができる。顔料の結合部位の大部分はクロロフィルa またはクロロフィルbのための完全に選択的ではないが、異なる親和性10,30,34であるが、両方を収容することができるので可能である。 38 –同様に、カロテノイド結合部位はまた、複数のキサントフィル種8,35に対応できることが示された。 CP26、各種の顔料組成物を用いて、高等植物、他の色素-タンパク質複合体の別の再構成は、 表2 39に示されている。これらの再構成は、特定の顔料39の結合部位の親和性を評価した。これは、同じ顔料cを有する複合体を得るために、ことに留意することが興味深い。1:ネイティブ一つとしてompositionは、顔料ミックスのクロロフィルa / bの比は3でなければなりません。これは高等植物20,40のすべてのLHC複合体のためのケースであると思われる。
再構成技術を用いて、分子生物学の組み合わせがクロロフィル結合複合体の性質をより詳細に研究することができます。 44 –異なるタンパク質複合体の安定性及び折り畳みドメイン、またはタンパク質-タンパク質相互作用への関与の重要性は、アポタンパク質を切り捨てる又はランダム突然変異誘発8,41を実行することによって決定されている。 52 –異なる顔料の調整のための重要な単一のアミノ酸残基は、個別の顔料の特性を分析したり、複雑な10,28,29,45の機能および安定性への寄与を評価するために、部位特異的変異誘発によって変更することができる。 図6ははとLhcb4(CP29)を再構成した位置216 53位のヒスチジンの変異。野生型および突然変異体複合体の顔料組成物の比較は、変異が標的部位は、WT複合体中のクロロフィルa を収容することを示す、分子1クロロフィルの喪失を誘導することを示す。 WTおよび変異体の吸収スペクトルの違いは、顔料の含有量に対して正規化の際に、また、失われた顔料の吸収特性を示している。この場合、差はクロロフィルHis216によってコーディネートこの波長で吸収する(この変異体についての詳細は、分光特性がモッツォら 、2008年53参照 )ことを示し、680nmでの主ピークに見ることができる。変異分析はまた、顔料54の分光特性に及ぼす環境の影響を決定するために用いることができる。
結論として、集光性タンパク質は、容易に顔料proteiその結果、in vitroで再構成することができる天然の複合体と非常に類似した特性を有するn複合体。また、さらなる研究のために高い収率および純度でタンパク質調製物を提供しながらこのように、天然のタンパク質を単離することの困難さは、排除される。 3の重要性:本物の複合体の製造における1クロロフィルa / bの比が強調され、再構成された野生型および変異LHCsの実施例は、技術の応用を説明するために提供される。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
HisTrap HP | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
Nylon cloth | 20 μm pores | ||
Soft artists paint brush | |||
NONIDET P-40 | Sigma | 74385 | |
Beta-DM | Sigma | D4641 | |
DNAase | ThermoScientific | EN0525 | |
Milk Powders | |||
RNAase | ThermoScientific | EN0531 | |
Sonicator | |||
Octyl β-D-glucopyranoside | Sigma | O8001 | |
Ultracentrifuge XL | Beckman-Coulter | ||
TAP medium | see reference 17 | ||
LB medium | see reference 19 |