This protocol details the reconstitution of light-harvesting complexes in vitro. These integral membrane proteins coordinate chlorophylls and carotenoids and are responsible for harvesting light in higher plants and green algae.
In planten en groene algen, wordt licht opgevangen door de light-harvesting complexen (LHCs), een familie van integrale membraaneiwitten die chlorofyl en carotenoïden te coördineren. In vivo, worden deze eiwitten gevouwen met pigmenten om complexen die in de thylakoidmembraan worden ingevoegd vormen van de chloroplast. De hoge gelijkenis in de chemische en fysische eigenschappen van de leden van de familie, en het feit dat zij gemakkelijk pigmenten kunnen verliezen tijdens isolatie, maakt hun zuivering in een natieve toestand uitdagend. Een alternatieve benadering homogene preparaten van LHCs verkrijgen werd ontwikkeld door Plumley en Schmidt in 1987 1, die aantoonde dat het mogelijk was om deze complexen in vitro uitgaande van gezuiverde pigmenten en ongevouwen apoproteins reconstitueren, waardoor complexen met eigenschappen vergelijkbaar met die van natuurlijk complexen. Dit maakte de weg vrij voor het gebruik van bacteriële expressie gebrachte recombinante eiwitten in vitro </em> reconstitutie. De reconstitutie werkwijze is krachtig om verschillende redenen: (1) zuivere preparaten van afzonderlijke complexen kan worden verkregen, (2) pigment samenstelling kan worden gecontroleerd om hun bijdrage beoordelen structuur en functie (3) recombinante proteïnen kunnen worden gemuteerd om de functionele studie rol van de afzonderlijke residuen (bijvoorbeeld pigment bindingsplaatsen) of eiwit domein (bijvoorbeeld eiwit-eiwit interactie, vouwen). Deze werkwijze is geoptimaliseerd in verschillende laboratoria en toegepast op het meeste licht-harvesting complexen. De hier beschreven protocol beschrijft de methode voor de reconstructie light-harvesting complexen in vitro momenteel gebruikt in ons laboratorium, en voorbeelden beschrijven toepassingen van de werkwijze voorzien.
De fotosynthese-apparaat van planten en algen bevatten integrale membraaneiwitten die chlorofyl a binden (chl a), b (chl b) en carotenoïden (auto). De pigment-eiwitcomplexen zijn actief in oogsten lichtenergie en overdracht die excitatie energie aan het reactiemengsel centra, waar het wordt gebruikt om ladingsscheiding 2 promoten. Ze zijn ook betrokken bij regulerende feedback mechanismen die de fotosynthese-apparaat van hoge lichte schade 3,4 beschermen. The light harvesting complexen (LHCs) bestaan uit een grote familie van verwante eiwitten in planten en algen 5.
De homogene zuivering van elk lid van de familie wordt bemoeilijkt door de zeer vergelijkbare chemische en fysische eigenschappen van de complexen. Bovendien zuiveringswerkwijzen vaak tot verlies van pigmenten of andere potentiële cofactoren zoals lipiden. In vitro reconstitutie vertegents een krachtige methode om deze problemen te overwinnen. De LHC verbonden fotosysteem II (LHC-II) werd eerst gereconstitueerd in vitro door Plumley en Schmidt in 1987 1. De onderzoekers geëxtraheerd ontvette eiwitten en pigmenten afzonderlijk van planten chloroplasten, en vervolgens gecombineerd warmte gedenatureerd eiwit met pigmenten in aanwezigheid van lithium Dodecyl Sulfate (LDS), gevolgd door drie cycli van invriezen en ontdooien 1. Zij toonden aan dat de spectrale eigenschappen van de gereconstitueerde LHC complexen waren zeer vergelijkbaar met complexen gezuiverd uit planten. Het gemak reconstitueren LHC pigment-eiwitcomplexen, waarschijnlijk vanwege een aantal inherente zelfassemblage functie, samen met de moeilijkheid om gezuiverde complexen uit organismen, tot de snelle vaststelling van de werkwijze door andere onderzoekers. De reconstitutie van fotosynthetische proteïnen overexpressie in Escherichia coli (E. coli) bereikt door Paulsen en collega's in 1990 6. In E.coli, overexpressie membraaneiwitten worden meestal verpakt in inclusielichamen, welke voorzieningen de zuivering. Reconstitutie wordt bereikt door hitte denaturatie van de inclusielichamen bevattende recombinant eiwit in aanwezigheid van LDS, gevolgd door de toevoeging van pigmenten die de eiwitvouwing initieert. Vouwen van de LHCII complex is een proces in twee stappen: eerst wordt chlorofyl een gebonden in minder dan 1 minuut; tweede, is chlorofyl b gebonden en gestabiliseerd gedurende enkele minuten 7.
Naast het verschaffen van inzicht in de vouwen dynamiek, in vitro reconstitutie gecombineerd met plaatsgerichte mutagenese heeft het mogelijk gemaakt specifieke aminozuren belangrijk voor stabiliteit (bijvoorbeeld 8,9) of pigment coördinatie (bijvoorbeeld 10). Manipulatie van het opnieuw vouwen voorwaarden door het aanpassen van parameters zoals pigmentsamenstelling of reinigingsmiddelen zijn ook geïdentificeerd elementen critical voor juiste vouwing, zoals het vereiste van xanthofyllen de LHCII complex (bijvoorbeeld 1,11). Bovendien is onderzoek naar de eigenschappen van afzonderlijke pigmenten gebonden aan de complexen onmogelijk geweest met complexen gereconstitueerd in vivo (bijvoorbeeld 10).
De hier beschreven methode begint met isolatie van pigmenten (chlorofylen en carotenoïden) uit spinazie en de groene alg Chlamydomonas reinhardtii. De expressie en zuivering van een LHC eiwit van E. coli in de vorm van inclusielichamen wordt vervolgens beschreven, gevolgd door de reconstructie van LHC en daaropvolgende zuivering met Ni affiniteitskolom. In de laatste stap worden de bereide complexen verder gezuiverd door sucrose gradiënt centrifugatie om pigmenten en ongevouwen apoproteïne verwijderen. Dit protocol vormt een geoptimaliseerde procedure waarin verscheidene wijzigingen die door verschillende laboratoria dan hebben ingevoerdtijd 1,6,10,12 -14.
Membraaneiwitten zijn niet zo makkelijk om te studeren. Isolatie van natieve membraaneiwitten wordt gecompliceerd door de noodzaak de lipide bilaag oplosbaar met detergentia die het eiwit kan beschadigen en verwijderen essentiële cofactoren. Deze eiwitten kunnen ook bij lage niveaus in biologische membranen, of wordt gemengd met nauw verwante eiwitten, zoals bij het light harvesting complexen, die zuivering van afzonderlijke complexen bemoeilijkt. Heterologe eiwitexpressie in E. coli en in vitro reconstitutie biedt de mogelijkheid om deze problemen te vermijden. In vitro reconstitutie en zuivering van gevouwen eiwitten resulteert in complexen die kenmerken vergelijkbaar met die van de natieve complexen 20,21,23 is er wel kan worden gebruikt om complexen die niet kunnen worden gezuiverd tot homogeniteit 24 studeren – 27.
Deze methode maakt gebruik van spinazie, dat is gemakkelijk attainable jaar door, als een bron voor het totale pigment en carotenoïdenpreparaten. Voor sommige reconstructies van eiwitten afkomstig uit algen, is het gebruik van pigmenten gezuiverd uit algen voorkeur vanwege verschillende pigment samenstellingen. De Chl a / b-verhouding en Chl / auto verhouding hetzelfde blijft ongeacht pigment bron.
Het is belangrijk te realiseren dat de efficiëntie van de reconstitutie gewoonlijk ongeveer 35% 28. Zo is het noodzakelijk om de niet-gebonden pigmenten en uitgeklapte apoprotein van de oplossing na de reconstitutie verwijderen. Een twee-staps zuiveringsproces protocol wordt gepresenteerd in dit protocol (zie ook resulteert). Er moet echter worden opgemerkt dat de sucrose gradiënt stap de volledige scheiding van apo-en holo-eiwit niet toestaat. Voor de meeste analyses is dit geen probleem, aangezien de apoproteïne geen pigmenten en dus niet interfereert met de functionele metingen. Daarom, moet het apo-eiwit volledig te verwijderen van de fractie met het gereconstitueerde complex (bijvoorbeeld om het pigment eiwit stoichiometrie berekenen) kan een anionische uitwisselende kolom gebruikt (zie Passarini et al. 2009 29 voor details).
Het vermogen om recombinante light harvesting eiwitten te hervouwen met geïsoleerde pigmenten in vitro biedt de gelegenheid om "manipuleren" de complexen door aanpassing van de reconstitutie "omgeving" op verschillende manieren, waardoor de kenmerken van het verkregen complex veranderen. Bijvoorbeeld, de pigment samenstelling verandert tijdens reconstitutie kan resulteren in een complex met gewijzigde pigment compositie. Deze functie kan worden gebruikt om de invloed van verschillende pigmenten op de structuur en stabiliteit van het complex te bestuderen. Meestal pigment preparaat met spinazie een Chl a / b verhouding van 3: 1 en een Chl / auto-verhouding van 2,9: 1. Deze verhouding geeft gewoonlijk een gereconstitueerd eiwit met dezelfde eigenschappen als de ntieve een. Echter, kan aanpassing van de Chl a / b-verhouding door toevoeging van gezuiverde Chl a of b beïnvloeden de binding van verschillende pigmenten door variabele selectiviteit van de bindingsplaatsen 30-33. Dit is mogelijk omdat de meeste pigment bindingsplaatsen niet volledig selectief voor Chl a of b Chl, maar is geschikt voor beide, zij het met verschillende affiniteit 10,30,34. Op soortgelijke wijze werden de carotenoïde bindingsplaatsen ook aangetoond kunnen meerdere xanthofyl species 8,35 tegemoet – 38. Verschillende reconstructies van CP26, een pigment-eiwitcomplex van hogere planten, met verschillende pigment samenstellingen worden getoond in Tabel 2 39. Deze reconstructies werden gebruikt om de affiniteit van bindingsplaatsen voor bepaalde pigmenten 39 beoordelen. Het is interessant op te merken dat, om een complex met hetzelfde pigment c verkrijgenAMENSTELLING als naturalness moet de Chl a / b-verhouding van pigment mix 3: 1. Dit lijkt het geval voor alle LHC complexen van hogere planten 20,40 zijn.
De combinatie van moleculaire biologie met de reconstitutie techniek kan de eigenschappen van een Chl-bindende complex te bestuderen in meer detail. Het belang van de verschillende eiwit domeinen op de stabiliteit en het vouwen van de complexen, of hun betrokkenheid bij de eiwit-eiwit interacties, zijn bepaald door het afkappen van de apo-eiwit of het uitvoeren van willekeurige mutagenese 8,41 – 44. Single aminozuurresiduen rol in de coördinatie van verschillende pigmenten kunnen worden veranderd door plaatsgerichte mutagenese om de eigenschappen van de individuele pigmenten analyseren of evalueren hun bijdrage aan de functie en stabiliteit van het complex 10,28,29,45 – 52. Figuur 6 toont gereconstitueerde Lhcb4 (CP29) meteen mutatie van de histidine op positie 216 53. Een vergelijking van de pigment samenstelling van wildtype en mutante complexen toont aan dat de mutatie induceert het verlies van Chl een molecuul, wat aangeeft dat de doelplaats herbergt een Chl een in de WT complex. De verschillen van de absorptiespectra van WT en mutante, na normalisatie naar het pigmentgehalte, toont ook de absorptie eigenschappen van de verloren pigment. In dit geval kan het verschil te zien in de grote piek bij 680 nm, wat aangeeft dat de Chl een gecoördineerd door His216 absorbeert bij deze golflengte (voor meer informatie over deze mutant en de spectroscopische eigenschappen zie Mozzo et al. 2008 53). Mutatie analyse kan ook worden gebruikt om het effect van het milieu op de spectroscopische eigenschappen van de pigmenten 54 bepalen.
Concluderend kan licht oogsten eiwitten gemakkelijk worden opgelost in vitro resulteert in pigment-protein complexen met zeer vergelijkbare eigenschappen met inheemse complexen. Op deze wijze worden de problemen isoleren natieve eiwitten geëlimineerd, terwijl het ook eiwitpreparaat met hoge opbrengst en zuiverheid voor verdere studie. Het belang van een 3: 1 Chl a / b-verhouding in het produceren van een authentiek complex wordt benadrukt, en voorbeelden van gereconstitueerde wildtype en mutante LHCs worden aan toepassingen van de techniek illustreren.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European research council by a ERC starting/consolidator grant to RC and by the Dutch Foundation for research on matter (FOM) via a FOM program (10TM01).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
HisTrap HP | GE Healthcare | 17-5247-01 | |
Nylon cloth | 20 μm pores | ||
Soft artists paint brush | |||
NONIDET P-40 | Sigma | 74385 | |
Beta-DM | Sigma | D4641 | |
DNAase | ThermoScientific | EN0525 | |
Milk Powders | |||
RNAase | ThermoScientific | EN0531 | |
Sonicator | |||
Octyl β-D-glucopyranoside | Sigma | O8001 | |
Ultracentrifuge XL | Beckman-Coulter | ||
TAP medium | see reference 17 | ||
LB medium | see reference 19 |