Упаковка с ВИЧ или FIV основе Lentivector Конструкции выражения и трансдукции VSV-G Pseudotyped вирусных частиц

1. Трансфекция 293TN Клетки с упаковки плазмиды и выражений Построить Семенной 7.0 – 8.0 х 10 6 клеток на 293TN 15 см 2 пластины культуры в 20 мл культуральной среде, содержащей DMEM среде с 4 мМ L-глутамина, 4,5 г / л, глюкоза, и эмбриональной телячьей сыворотки (10%) без антибиотиков. Расти в течение 18-24 часов при 37 ° C с 5% CO 2, так что плотность клеток достигает 60-80% слияния во время трансфекции. В некоторых случаях может оказаться необходимым, чтобы семена нескольких пластин клеток получить достаточно высокий титр для трансдукции клеток-мишеней. Для каждой пластине клеток, добавляют 1,6 мл бессывороточной DMEM в автоклаве 2 трубками мл Eppendorff. Добавьте 45 мкл pPACKH1 или pPACKF1 и 4,5 мкг ваш lentivector построить в DMEM и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Добавить 55 мкл PureFection в ту же трубу. Vortex в течение 10 секунд. Инкубируйте DMEM-плазмиды-PureFection смесь при комнатной температуре еили 15 мин. Добавить DMEM-плазмиды-PureFection смесь на плиту культуры тканей каплям и водоворот осторожно, чтобы равномерно рассеять по всему пластины. Вернуться блюдо в инкубатор и расти при температуре 37 ° C с 5% CO 2. Существует нет необходимости менять СМИ после трансфекции. Если lentivector конструкция выражает ген, кодирующий флуоресцентный белок GFP, как, проверьте ваши клетки под микроскопом 12-24 часов после трансфекции. Вы должны быть в состоянии видеть> 90% GFP-положительных клеток, что указывает на трансфекции была успешной. Соберите супернатант культуры клеток через 48 и 72 часов в 50 мл стерильной пробирке центрифуги. Это супернатант культуры клеток в настоящее время содержит инфекционных pseudoviral частиц. (Следовать рекомендациям руководства по работе с классом безопасности BSL-2). Центрифуга на 1500 мкг в течение 15 мин при комнатной температуре в гранулах сотовой мусора. Передача вирусной супернатант в новую пробирку, обеспечивая, чтобы не нарушить гранул. 293TN клетки, которые были использованы для вирусной упаковку следует выбрасывать в контейнер для биологически опасных и не могут быть использованы для дальнейших раундов вирусной упаковке. 2. Концентрация вирусной Супернатант Добавить 1 объем холодного (4 ° С) PEG-это вирус осадков Решение каждые 4 объема лентивирусов частиц содержащих супернатант. Осаждение лентивирусов частиц из больших объемов может быть достигнуто с Corning 250 мл полипропиленовые трубы центрифуги. Смешать решения путем обращения труб в несколько раз, но не вихрь смеси. Охладите раствор при температуре 4 ° С в течение не менее 12 часов (до 4 дней приемлемо). Не трясите и не повернуть трубы в холодильной шаг. Центрифуга супернатант / PEG-это смесь при 1500 мкг в течение 30 минут при 4 ° C. После центрифугирования лентивирусов частицы будет выглядеть как бежевый или белый шарик в нижней части трубы. Вылейте supernataNT. Удалите все следы жидкости стремления, стараясь не нарушить осажденного лентивирусов частиц в гранулах. Следы остаточных PEG-это разбавить вирус (тем самым уменьшая титр), но не влияет на целостность клетки-мишени с PEG-он инертен и не токсичен. Ресуспендируйте и объединить лентивирусов частиц в 1/100 первоначального объема с использованием холодного (4 ° С), стерильный фосфатный буферный раствор или DMEM, содержащей 25 мМ HEPES буфера. Алиготе в стерильные флаконы и криогенных магазине при -70 ° С до готовности к использованию. 3. Вирусный Titering и трансдукция клеток-мишеней Мы рекомендуем titering лентивирусов частиц до трансдукции клеток-мишеней, из интереса и расчета соответствующих множественности заражения (МВД) на клетки-мишени для согласованности между экспериментами. Для вирусного titering, мы рекомендуем использовать HT1080 клеток простой в заразить положительного контроля линии. Plпростота отметить, что протокол предполагает titering трансдуцирующих HT1080 клетки с небольшим аликвоту лентивирусов частиц вы упаковке. После титров известно, клетки-мишени интересов, также может быть трансдуцированных производится лентивирусов частиц. Рекомендуется titering протокола можно найти по адресу: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7. Пластина 50000 клеток-мишеней интересов, на лунку в 24-луночного планшета в средствах массовой культуре клеток. Использование средств массовой информации, что клетки, как правило, культивировали дюйма Рост клеток в течение ночи при определенных условиях их культуры. Клетки должны быть в пределах от 50 до 70% сливающийся в день трансдукции. В день трансдукции, аспирации средства массовой информации от клетки. Комбинат питательной среде с TransDux до 1 х конечной концентрации (например, 2,5 мкл TransDux до 500 мкл питательной среды). Затем перенесите TransDux-сеLL смесь питательной среды в каждую лунку. Пипетировать соответствующий объем вирус, который соответствует оптимальному МВД на клетки-мишени в каждую лунку. Если оптимальный МВД неизвестно, мы рекомендуем попробовать целый ряд различных Mois (например, МВД 1, 2 и 5 простых в инфицировать клетки культуры ткани и МВД 1, 10 и 20 для более трудных для заразить первичные клетки). Если концентрация частиц лентивирусов не известна (определяется на основе протокола titering вируса), различных объемов вируса можно попробовать, например, 1, 2 и 5 мкл вируса. Вирус может находиться в контакте с клетками-мишенями на срок до 72 часов. Дальнейшие эксперименты с клетками-мишенями трансдуцированных интересов, может быть начато через 72 часа после трансдукции, когда вирусные конструкции интегрировался в геном клетки-хозяина. Изменение средних и прохождение клеток-мишеней интересов, в соответствии с их конкретными потребностями. 4. Представитель Результаты <pкласс = "jove_step"> Трансфекция 293TN клеток Начальная плотность 293TN клеток имеет решающее значение для успешной вирусной упаковке. 293TN клетки должны быть от 60 до 80% сливной день трансфекции (рис. 2). Если 293TN клеток менее 60% вырожденная, дать им возможность расти в течение нескольких часов, прежде чем трансфекции. Если 293TN клеток> 80% вырожденная, то они должны быть replated до трансфекции. При использовании lentivector выражения GFP, по крайней мере 90% 293TN клетки должны светиться зеленым через 24 часа после трансфекции, что указывает на успешное трансфекции (рис. 3). Если менее чем 90% клеток GFP-положительных, не переходите к следующему шагу, потому что это означает, что трансфекция не была успешной, и вирусные титры будет низкой. Вместо пластины нового 293TN клетки и начать заново, убедившись, что 293TN клетки на должном плотность клеток до трансфекции. 293TN клетки могут снять плиты культуре тканей 48-72 часов после трансфекции. Это не оказывает негативного воздействия производства лентивирусов частиц. Titering с HT1080 клетки Вирусные титры можно вычислить с помощью глобальной сверхбыстрой комплект ВОО Titering в соответствии с инструкциями производителя. Эта система использует КПЦР для измерения вирусной интеграции WPRE последовательность из лентивирусов вектора в клетки HT1080 и сравнивает их со стандартной кривой, на основе геномной последовательности ссылку, чтобы точно измерить инфекционных единиц на мл (рис. 4). Трансдукция клеток-мишеней При использовании лентивирусов частиц выразил конститутивно GFP маркер, GFP-положительных клеток должны начать появляться в течение 12-24 часов трансдукции, если трансдукции реакции работает. GFP выражение должно продолжаться после того, как конструкция лентивирусов стабильно интегрируется в тОн пройдет геном клетки. Если трансдукции с различными Mois, GFP флуоресценции должно примерно соответствовать МВД, где низкая Mois показать флуоресценции GFP меньше и выше Mois шоу увеличилось флуоресценция GFP (рис. 5). Рисунок 1. Обзор вирусной Протокол производства. Lentivector и pPACK плазмиды упаковки смешиваются и совместно трансфекции в 293TN клеток. Через 48 -72 часов, вирусная супернатант собирали, и вирусные частицы осаждаются PEG-он. После titering лентивирусов частиц, они могут быть использованы для трансдукции клеток-мишеней, из интереса. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок . Рисунок 2. Фазового контраста изображения 293TN клеток. Сотовые DensitУ должна быть в пределах 60-80% сливной день трансфекции. Рисунок 3. Флуоресцентное изображение GFP-положительных клеток 293TN 24 часов после трансфекции Purefection, pPACKH1 и lentivector кодирования конструкции GFP. Рисунок 4. WPRE КПЦР результатов и стандартной кривой полученные с помощью глобальной сверхбыстрой комплект ВОО в Titering рассчитать МВД и соответствующим титром упакованных вирусных частиц. Рисунок 5. Флуоресцентные изображения HT1080 клеток трансдуцированных с увеличением количества лентивирусов. Изображения с 72 часов после трансдукции.