포장 HIV 또는 FIV 기반 Lentivector 식 구조 및 VSV-G Pseudotyped 바이러스성 입자의 형질 도입

1. 포장 Plasmids있는 293TN 세포의 Transfection과 표현이 건설 종자 7.0-8.0 X 10 4 MM L-글루타민, 4.5 g / L 포도당과 항생제없이 태아 소 혈청 (10 %)로 보완 DMEM 매체를 포함하는 배지 20 ML에서 15cm이 문화 판 당 6 293TN 세포. 세포 밀도가 transfection시 confluency 60~80%에 도달되도록 2 5 %의 CO와 37 ° C에서 18~24시간 동안 성장. 어떤 경우에는 그것은 표적 세포의 형질 도입에 대한 높은만큼 titer를 얻기 위해 세포의 씨앗 몇 접시로 필요할 수 있습니다. 세포의 각 플레이트의 경우 autoclaved이 ML Eppendorff 튜브 1.6 ML 혈청이없는 DMEM를 추가합니다. 당신의 lentivector 45 μl pPACKH1 또는 pPACKF1 및 4.5 μg 아래로 pipetting 및하여 DMEM과 믹스에 건설을 추가합니다. 같은 튜브에 PureFection의 55 μl를 추가합니다. 10 초 동안 와동. 실내 온도 F에서 DMEM-플라스미드-PureFection 혼합물을 품어15 분. 조직 배양 플레이트 골고루 접시에 걸쳐 분산하여 부드럽게 드롭 현명하고 소용돌이에 DMEM-플라스미드-PureFection 혼합물을 추가하십시오. 인큐베이터에 접시를 반환 5 % CO 2와 37 ° C에서 성장. transfection 후 미디어를 변경할 필요는 없습니다. 당신의 lentivector 구조가 GFP와 같은 형광 단백질을 인코딩 유전자를 표현하는 경우 12-24시간 transfection 후 현미경으로 세포를 확인합니다. 당신은 transfection에 성공했다는 의미> 90% GFP 양성 세포를 볼 수 있습니다. 50 ML 멸균 원심 튜브에 세포 배양 48 후 뜨는 및 72 시간 수집합니다. 이것은 세포 배양 뜨는 지금 전염성 pseudoviral 입자를 포함하고 있습니다. 펠렛에 상온에서 15 분 세포 파편을위한 1,500 XG에서 (BSL-2 안전 클래스 작업에 대한 권장 지침을 따르십시오.) 원심 분리기. 펠렛을 방해하지 않도록 보장하는 새로운 튜브에 바이러스 표면에 뜨는을 전송합니다. 바이러스성 포장에 사용되었습니다 293TN 세포 생물 학적 용기에 폐기 및 바이러스 포장의 추가 라운드에 사용할 수 없습니다되어야합니다. 2. 바이러스성 뜨는의 농도 한 감기 부피 (4 ℃) lentiviral 입자 함유 뜨는의 모든 4 권까지 PEG-그것 바이러스 강수량 솔루션입니다. 추가 큰 볼륨에서 lentiviral 입자의 강수는 코닝 250 ML의 폴리 프로필렌의 원심 분리기 튜브 구현할 수 있습니다. 반전 튜브를 여러 번하여 솔루션을 섞어지만, 혼합물 와동하지. (최대 4 일 수용) 최소한 12 시간 동안 4 ° C에서 솔루션을 냉장. 흔들거나 냉각 단계에서 튜브를 회전하지 마십시오. 4에서 30 분 1,500 XG에 뜨는 / PEG-그 혼합물을 원심 ° C. 원심 분리 후, lentiviral 입자 튜브 하단의 베이지색이나 흰색 펠렛으로 표시됩니다. supernata을 붓고NT. 펠렛의 시켰던 lentiviral 입자를 방해하지 않도록 돌보는 열망에 의해 유체의 모든 흔적을 제거합니다. 성분이 잔류 PEG-그것이 바이러스를 희석합니다 (따라서 titer를 줄여)하지만 PEG-그것이 불활성과 독성이되지 않기 때문에 대상 세포의 무결성에 영향을주지 않습니다. Resuspend (4 ℃) 추위를 사용하여 원래 볼륨의 1 / 100 lentiviral 입자를 결합, 멸균 인산은 식염수 버퍼 혹은 DMEM이 25 밀리미터 HEPES 버퍼를 포함. 사용할 준비까지 살균 극저온 튜브와 -70에서 매장 ° C로 나누어지는. 3. 대상 세포의 바이러스성 Titering 및 형질 도입 우리는 표적 세포 -의 – 관심을 transducing과 실험 사이의 일관성을위한 대상 세포에 대한 감염의 적절한 다수를 (방어) 계산 전에 lentiviral 입자를 titering 좋습니다. 바이러스성 titering 위해서는 쉬운 감염 긍정적인 제어 라인으로 HT1080 세포를 사용하는 것이 좋습니다. 경기수titering 프로토콜 당신이 포장했습니다 lentiviral 입자의 작은 나누어지는로 HT1080 세포를 transducing 포함합니다을 쉽게. titer가 알려져되면, 대상 세포 -의 – 관심은 또한 생산 lentiviral 입자로 transduced 수 있습니다. : 권장 titering 프로토콜에서 찾을 수 http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7. 세포 배양 매체에서 24 잘 판에 잘마다 플레이트 50,000 표적 세포 -의 – 관심. 세포가 정상적으로 자신의 특정 문화 상황에서 인치 배양해 세포가 하룻밤 사이에 성장하고있는 미디어를 사용하십시오. 세포는 형질 도입 당일 합류 % 70-50 사이 여야합니다. 형질 도입의 날에는 세포에서 미디어를 기음. 1 X 최종 농도 (예를 들어, 2.5 μl TransDux 500 문화 매체 μl)로 TransDux와 문화 매체를 결합. 그런 다음 TransDux-CE를 전송각도에 표시됩니다 배지 혼합. 각도에 목표 세포에 대한 방어 최적에 해당하는 바이러스의 적절한 볼륨을 피펫. 최적 입니다만 알 수있다면, 우리는 다른 MOIs의 범위 (예 : 방어 1, 2, 5의 조직 배양 세포를 손쉽게 감염을위한, 그리고 입니다만 더 어렵습 대 1, 10, 20 등 노력하는 것이 좋습니다 ) 기본 세포를 감염. lentiviral 입자의 농도는 (같은 바이러스 titering 프로토콜을 통해 결정) 알려져 있지 않은 경우, 바이러스의 서로 다른 볼륨이 같은 바이러스의 1, 2, 5 μl로 재판을받을 수 있습니다. 바이러스가 72시​​간에 대한 타겟 세포와 접촉에 남아있을 수 있습니다. 과 추가 실험 대상 세포를 중 – 관심 transduced 바이러스 구조가 숙주 세포의 게놈에 통합되면, 도입 후 72 시간 시작됩니다. 그들의 특정 요구에 따라 세포 -의 – 관심 매체와 통과 목표를 변경합니다. 4. 대표 결과 <p293TN 세포의 클래스 = "jove_step"> Transfection 293TN 세포의 시작 밀도는 성공적인 바이러스성 포장에 중요합니다. 293TN 세포는 transfection의 날 (그림 2) % -80 60 사이에 합류해야합니다. 293TN 세포가 60 % 합류 미만의 경우 그들 transfection을 시도하기 전에 몇 시간 동안 성장할 수 있습니다. 293TN 세포가> 80 %의 합류있다면, 그들은 transfection하기 전에 replated해야합니다. lentivector 표현 GFP를 사용하는 경우 293TN 세포의 적어도 90 %는 성공적인 transfection (그림 3)을 나타내는 transfection 후 24 시간 안에 녹색 형광한다. 세포의 미만 90 %가 GFP 양성면이 transfection이 성공적이지 않았음을 나타냅니다, 그리고 바이러스 titers 낮게되므로, 다음 단계로 진행하지 않습니다. 대신 플레이트 새로운 293TN 세포 transfecting 전에 293TN 세포가 적절한 세포 밀도에서한지 만드는 시작. 293TN 세포 48~72시간 transfection 후 조직 배양 플레이트라고 결론 지었다 수 있습니다. 이것은 부정적인 lentiviral 입자의 생산에 영향을주지 않습니다. HT1080 세포와 Titering 바이러스성 titers는 제조 업체의 지침에 따라 SBI의 글로벌 UltraRapid Titering 키트를 사용하여 계산하실 수 있습니다. 이 시스템은 HT1080 세포로 lentiviral 벡터에서 WPRE 순서 바이러스 통합을 측정하는 qPCR을 활용하고 정확하게 ML 당 전염성 단위 (그림 4)을 측정할 수있는 게놈 참조 시퀀스를 기반으로, 표준 곡선에 이것을 비교합니다. 대상 세포의 형질 도입 constitutively 활성 GFP를 마커를 표현하는 lentiviral 입자를 사용하는 경우 형질 도입 반응이 작동하는 경우, GFP 양성 세포는 형질 도입의 12~24시간 이내에 나타나기 시작합니다. lentiviral 구조가 안정적으로 t으로 통합 후 GFP 발현은 계속한다그는 세포 게놈을 호스팅할. 다른 MOIs으로 transducing 경우, GFP 형광은 약 입니다만, 낮은 MOIs는 GFP 형광을 (그림 5) 증가 않음 이하 GFP의 형광과 높은 MOIs 표시 위치와 일치해야합니다. 그림 1. 바이러스 생산 프로토콜의 개요. lentivector 및 pPACK 포장 plasmids은 혼합 및 293TN 세포로 공동 transfected 있습니다. 48 -72 시간이 흐른 바이러스 뜨는가 수집되고, 바이러스 입자는 PEG-그것으로 시켰던 있습니다. lentiviral 입자 titering 후, 그들은 세포 -의 – 관심 대상을 transduce하는 데 사용할 수 있습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 누르십시오 . 293TN 세포의 그림 2. 위상 콘트라스트 이미지입니다. 세포 density는 60-80%의 합류 transfection 당일 사이 여야합니다. 그림 3. 24시간 Purefection, pPACKH1 및 lentivector 구조 인코딩 GFP로 transfection 후 GFP 양성 293TN 세포의 형광 이미지입니다. 그림 4. WPRE의 qPCR 결과와 방어 및 포장 바이러스 입자의 대응 titer를 계산하는 SBI의 글로벌 UltraRapid Titering 키트를 이용하여 얻은 표준 곡선. HT1080 세포의 그림 5. 형광 이미지 lentivirus의 증가 금액으로 transduced. 이미지 72 시간 이후부터 도입입니다.