Embalaje VIH o FIV basados ​​en lentivirus Construcciones de expresiones y de transducción de la VSV-G partículas virales pseudotyped

1. La transfección de células con plásmidos 293TN de embalaje y de Expresión de la Construcción Semillas 7,0 a 8,0 x 10 6 293TN células por placa de 15 cm de cultura 2 en 20 ml de medio de cultivo que contiene medio DMEM suplementado con 4 mM de L-glutamina, 4,5 g de glucosa / l, y suero bovino fetal (10%) sin antibióticos. Crecer durante 18-24 horas a 37 ° C con 5% de CO 2 de manera que la densidad celular alcanza 60-80% de confluencia en el momento de la transfección. En algunos casos, puede ser necesario para las placas de semillas de varias células para obtener un alto título suficiente para la transducción de las células diana. Para cada placa de las células, añadir 1,6 ml de DMEM libre de suero a un autoclave tubo 2 ml Eppendorff. Añadir 45 l pPACKH1 o pPACKF1 y 4,5 g de la construcción de lentivirus de la DMEM y mezcla pipeteando arriba y hacia abajo. Añadir 55 l de PureFection en el mismo tubo. Vortex durante 10 segundos. Incubar el DMEM-plásmidos PureFection mezcla a temperatura ambiente fo 15 min. Agregue el DMEM-plásmidos PureFection mezcla a la placa de cultivo de tejidos, gota a gota y agitar suavemente para dispersar uniformemente en toda la placa. Vuelva a colocar el plato a la incubadora y crecer a 37 ° C con 5% de CO 2. No hay necesidad de cambiar los medios de comunicación después de la transfección. Si su lentivirus construcción expresa un gen que codifica una proteína fluorescente GFP, como, revisar sus células bajo el microscopio de 12-24 horas después de la transfección. Debería ser capaz de ver las células> 90% GFP-positivo, lo que indica que la transfección se realizó correctamente. Recoger el sobrenadante del cultivo de células después de 48 y 72 horas en un tubo de centrífuga de 50 ml estéril. Este sobrenadante del cultivo celular ahora contiene partículas infecciosas pseudoviral. (Siga las pautas recomendadas para trabajar con la clase de seguridad BSL-2.) Se centrifuga a 1.500 xg durante 15 min a temperatura ambiente para precipitar los restos celulares. Transferir el sobrenadante viral a un nuevo tubo, asegurando de no perturbar el sedimento. Células 293TN que han sido utilizados para el envasado viral debe ser eliminado de un contenedor séptico y no han de ser utilizados para rondas adicionales de embalaje viral. 2. La concentración del sobrenadante viral Añadir 1 volumen de frío (4 ° C) de PEG-lo solución de precipitación virus a cada 4 volúmenes de lentiviral partícula que contiene sobrenadante. La precipitación de partículas lentiviral de grandes volúmenes se puede lograr con Corning 250 tubos de centrífuga de polipropileno ml. Mezclar la solución por los tiempos de inversión de los tubos varias, pero no del vórtice de la mezcla. Refrigerar la solución a 4 ° C durante al menos 12 horas (hasta 4 días es aceptable). No agitar o rotar los tubos durante la etapa de refrigeración. Centrifugar el sobrenadante / PEG-se mezcla a 1.500 xg durante 30 minutos a 4 ° C. Después de la centrifugación, las partículas lentiviral aparecerá como un precipitado de color beige o blanco en la parte inferior del tubo. Vierta el supernatant. Quite todos los rastros de líquido por aspiración, teniendo cuidado de no alterar las partículas precipitadas lentivirales en el sedimento. Trazas de PEG-residual se va a diluir el virus (reduciendo así el título), pero no afecta a la integridad de las células diana desde el PEG-que es inerte y no tóxico. Resuspender y combinar las partículas lentiviral en 1/100 del volumen original utilizando frío (4 ° C), fosfato estéril o solución salina tamponada con DMEM que contenía 25 mM de tampón HEPES. Dividir en partes alícuotas en viales criogénicos estériles y se almacena a -70 ° C hasta que estén listos para su uso. 3. Titulación viral y transducción de las células diana Le recomendamos titulación de las partículas antes de la transducción de lentivirus el objetivo de las células de interés y el cálculo de la multiplicidad caso de infección (MOI) de las células diana para la coherencia entre los experimentos. Tituló el virus, se recomienda utilizar las células HT1080 como una línea de control fácil de infectar a positivo. Pl.facilidad en cuenta que el protocolo titering implica transducir células HT1080 con una pequeña alícuota de las partículas lentiviral que han envasados. Una vez que el título se sabe, las células diana de interés también puede ser transducidas con las partículas producidas lentivirales. Un protocolo de Titulación recomendamos se puede encontrar en: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7. Placas 50.000 células diana de interés por pocillo en una placa de 24 pocillos en medio de cultivo celular. Utilice los medios de comunicación que las células normalmente se cultivan in crecer las células durante la noche en sus condiciones de cultivo específicas. Las células deben ser entre 50 a 70% confluentes en el día de la transducción. En el día de la transducción, aspirar los medios de comunicación de las células. Combinar medio de cultivo con TransDux a una concentración de 1 x final (por ejemplo, 2,5 l TransDux a 500 l de medio de cultivo). A continuación, traslado de la TransDux-ceEl cultivo LL mezcla medio a cada pocillo. Pipetear el volumen apropiado de virus que corresponde a la óptima MOI para las células diana en cada pocillo. Si la MOI óptimo es desconocido, se recomienda tratar una gama de diferentes MOI (tal como una MOI de 1, 2 y 5 para fácil de infectar las células de cultivo de tejidos, y una MOI de 1, 10 y 20 para más difíciles de a infectar a las células primarias). Si la concentración de las partículas lentiviral no es conocido (como se determina a través de un protocolo titering virus), diferentes volúmenes de virus puede ser tratado, tal como l 1, 2 y 5 del virus. El virus puede permanecer en contacto con las células diana por hasta 72 horas. Otros experimentos con las células transducidas de interés objetivo puede ser iniciada 72 horas después de la transducción, una vez que el constructo viral ha integrado en el genoma de la célula huésped. Cambiar el medio y el paso de la meta de las células de interés de acuerdo a sus necesidades específicas. 4. Los resultados representativos <pclass = "jove_step"> La transfección de células 293TN La densidad inicial de las células 293TN es crítico para el envasado viral exitosa. Células 293TN debe estar entre 60 -80% confluente el día de la transfección (Figura 2). Si las células 293TN son menos del 60% confluentes, que puedan crecer durante unas horas más antes de intentar la transfección. Si las células son confluentes 293TN> 80%, deben ser replated antes de la transfección. Si se utiliza un GFP lentivirus expresar, por lo menos 90% de las células 293TN debe fluorescencia verde 24 horas después de la transfección, lo que indica una transfección exitosa (Figura 3). Si menos del 90% de las células son GFP-positivo, no proceda con el siguiente paso, porque esto indica que la transfección no tuvo éxito, y los títulos virales será baja. En cambio, la placa 293TN nuevas células y empezar de nuevo, asegurándose de que las células son 293TN a la densidad celular adecuada antes de la transfección. 293TN células pueden quitar las placas de cultivo de tejidos de 48-72 horas después de la transfección. Esto no afecta negativamente a la producción de partículas lentivirales. Titulando con células HT1080 Los títulos virales se puede calcular utilizando el kit de OSE global Titulación ultrarrápido de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Este sistema utiliza qPCR para medir la integración de la secuencia viral WPRE a partir del vector lentiviral en las células HT1080 y la compara con una curva estándar, basada en una secuencia de referencia genómico para medir con precisión las unidades infecciosas por ml (Figura 4). La transducción de las células diana Si se utiliza partículas lentivirales que expresan un marcador GFP constitutivamente activa, las células GFP positivos deberían comenzar a aparecer dentro de 12-24 horas de la transducción, si la reacción de transducción está trabajando. La expresión de GFP debe continuar después de la construcción se integra en forma estable lentiviral tél alojar genoma de la célula. Si con la transducción de las MOI diferentes, la fluorescencia de GFP aproximadamente debe coincidir con el momento de inercia, donde las MOI bajas muestran una menor fluorescencia de la GFP y el aumento de las MOI muestran un aumento de la fluorescencia de GFP (Figura 5). Figura 1. Visión general del protocolo de la producción viral. Los plásmidos de envasado y lentivirus PPACK se mezclan y se co-transfectaron en células 293TN. Después de 48 -72 horas, el sobrenadante viral se recoge, y las partículas virales se precipitó con PEG-ella. Después de titulación de las partículas lentivirales, que puede ser utilizado para la transducción de la meta de las células de interés. Haga clic aquí para ver más grande la figura . Figura 2. Fase de contraste de imagen de las células 293TN. Celular Density debe ser de entre 60-80% confluente el día de la transfección. Figura 3. La imagen fluorescente de las células GFP-positivas 293TN 24 horas después de la transfección con Purefection, pPACKH1, y un lentivirus GFP construir codificación. Figura 4. Resultados WPRE qPCR y la curva estándar obtenida usando el kit de Global OSE Titulación ultrarrápido para el cálculo de MOI y el título correspondiente de paquetes de partículas virales. Imágenes de la Figura 5. Fluorescentes de las células HT1080 transducidas con cantidades crecientes de los lentivirus. Las imágenes son de 72 horas después de la transducción.