Packaging HIV o FIV-based Lentivector costrutti di espressione e di trasduzione del VSV-G Pseudotyped particelle virali

1. Trasfezione di cellule 293TN con i plasmidi di imballaggio e il costrutto di espressione Seme 7,0-8,0 x 10 6 cellule per 293TN 15 cm 2 piastra di coltura in 20 ml di terreno di coltura contenente DMEM supplementato con 4 mM L-glutammina, 4,5 g / l glucosio, e siero fetale bovino (10%) senza antibiotici. Crescere per 18-24 ore a 37 ° C con 5% CO 2 in modo che la densità cellulare raggiunge il 60-80% di confluenza al momento della transfezione. In alcuni casi, potrebbe essere necessario piastre semi diversi di cellule per ottenere un alto titolo sufficiente per la trasduzione delle cellule bersaglio. Per ogni piatto di cellule, aggiungere 1,6 ml di siero-free DMEM ad un tubo sterilizzato 2 ml Eppendorff. Aggiungere 45 microlitri pPACKH1 o pPACKF1 e 4,5 microgrammi di costruire il tuo lentivector al DMEM e mescolare pipettando su e giù. Aggiungere 55 pl di PureFection nel tubo stesso. Vortex per 10 secondi. Incubare il plasmide-PureFection DMEM f miscela a temperatura ambienteo 15 min. Aggiungere il plasmide-PureFection DMEM miscela alla piastra di coltura tissutale e goccia a goccia e agitare delicatamente per disperdere in modo uniforme in tutto il piatto. Ritorna il piatto per l'incubatore e di crescere a 37 ° C con 5% di CO 2. Non è necessario modificare il media dopo trasfezione. Se il costrutto lentivector esprime un gene che codifica una proteina fluorescente GFP come, controllare le cellule sotto il microscopio 12-24 ore dopo la trasfezione. Dovreste essere in grado di vedere le cellule> 90% GFP-positive, indicando che la transfezione ha avuto successo. Raccogliere il supernatante di coltura cellulare dopo 48 e 72 ore in una provetta da centrifuga 50 ml sterile. Il supernatante di coltura cellulare contiene ora particelle infettive pseudoviral. (Seguire le linee guida consigliate per lavorare con classe di sicurezza BSL-2.) Centrifugare a 1500 xg per 15 minuti a temperatura ambiente per far sedimentare i detriti cellulari. Trasferire il surnatante virale in una nuova provetta, assicurando non disturbare il pellet. 293TN cellule che sono state usate per il confezionamento virale devono essere smaltiti in un contenitore rischio biologico e non devono essere utilizzati per cicli di confezionamento virale. 2. Concentrazione del surnatante virale Aggiungere 1 volume di freddo (4 ° C) PEG-it soluzione precipitazioni Virus per ogni 4 volumi di lentivirale contenente particelle supernatante. Precipitazione di particelle lentivirali da grandi volumi può essere realizzato con Corning 250 provette per centrifuga in polipropilene ml. Mescolare la soluzione invertendo i tubi diverse volte, ma non vortex la miscela. Refrigerare la soluzione a 4 ° C per almeno 12 ore (fino a 4 giorni è accettabile). Non agitare o ruotare i tubi durante la fase di refrigerazione. Centrifugare il supernatante / PEG-si miscela a 1.500 xg per 30 minuti a 4 ° C. Dopo centrifugazione, le particelle lentivirali apparirà come un beige o bianco pellet sul fondo del tubo. Versare il supernatant. Eliminare tutte le tracce di liquido per aspirazione, facendo attenzione a non disturbare le particelle precipitate lentivirali nel pellet. Tracce di residuo PEG-verrà diluire il virus (riducendo così il titolo), ma non compromette l'integrità delle cellule bersaglio dal PEG-è inerte e non tossico. Risospendere e combinare le particelle lentivirali in 1/100 del volume originale usando freddo (4 ° C), fosfato sterile o soluzione salina tamponata con DMEM contenente 25 mM di tampone HEPES. Aliquotare in fiale sterili criogenici e conservare a -70 ° C fino al momento dell'uso. 3. Titolazione virale e trasduzione delle cellule bersaglio Si consiglia di titolazione delle particelle lentivirali prima trasduzione celle di destinazione d'interesse e calcolando la molteplicità appropriata di infezione (MOI) per le cellule bersaglio per la coerenza tra esperimenti. Per la titolazione virale, si consiglia di utilizzare le cellule HT1080 come facile da infettare positivo linea di controllo. Plfacilità di notare che il protocollo di titolazione coinvolge trasduzione HT1080 cellule con una piccola aliquota delle particelle lentivirali che hai confezionato. Una volta che il titolo è noto, le cellule bersaglio d'interesse può anche essere trasdotti con le particelle prodotte lentivirali. Un consiglio protocollo titolazione è disponibile all'indirizzo: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7. Piatto 50.000 cellule bersaglio d'interesse per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti in terreni di coltura delle cellule. Utilizzare i mezzi di comunicazione che le cellule sono normalmente coltivate dentro crescere le cellule durante la notte nelle loro specifiche condizioni di coltura. Le cellule devono essere tra il 50 al 70% confluenti il ​​giorno di trasduzione. Il giorno di trasduzione, aspirare i mezzi dalle cellule. Combinare mezzo di coltura con TransDux ad una concentrazione finale di 1 x (per esempio, 2,5 TransDux pl a 500 pl di mezzo di coltura). Poi trasferire il TransDux ce-ll mezzo di miscela di coltura in ciascun pozzetto. Pipettare il volume appropriato di virus che corrisponde alla MOI ottimale per le cellule bersaglio in ciascun pozzetto. Se la MOI ottimale è sconosciuto, si consiglia di provare una gamma di MOI diversi (ad esempio un MOI di 1, 2 e 5 per facili da infettare-colture tissutali, e un MOI di 1, 10 e 20 per più di difficile -infettare le cellule primarie). Se la concentrazione delle particelle lentivirali non è nota (come determinato mediante un protocollo di titolazione virus), diversi volumi di virus può essere processato, come pl 1, 2 e 5 di virus. Virus può rimanere in contatto con le cellule bersaglio fino a 72 ore. Ulteriori esperimenti con le cellule trasdotte-di-interesse bersaglio può essere iniziata 72 ore dopo la trasduzione, una volta che il costrutto virale è integrato nel genoma della cellula ospite. Modificare il medium e il passaggio celle di destinazione d'interesse in base alle loro specifiche esigenze. 4. Risultati rappresentativi <pclass = "jove_step"> trasfezione di cellule 293TN La densità iniziale delle cellule 293TN critiche per imballaggio virale. Cellule 293TN deve essere compresa tra 60% -80 confluenti il giorno di trasfezione (Figura 2). Se le cellule 293TN sono inferiori al 60% confluenti, permettere loro di crescere per qualche ora in più prima di tentare la transfezione. Se le cellule confluenti sono 293TN> 80%, devono essere ripiastrate prima della transfezione. Se si utilizza un GFP lentivector esprime, almeno il 90% delle cellule 293TN dovrebbero fluorescenza verde 24 ore dopo la trasfezione, indicando una trasfezione con successo (Figura 3). Se meno del 90% delle cellule sono GFP-positive, non procedere alla fase successiva, perché questo indica che la trasfezione non ha avuto successo, i titoli virali e sarà basso. Invece, piastre nuove cellule 293TN e ricominciare da capo, facendo in modo che le cellule 293TN sono la densità delle cellule corretto prima di trasfezione. Cellule 293TN può tirare fuori le piastre di coltura di tessuto 48-72 ore dopo la trasfezione. Ciò non influisca negativamente sulla produzione di particelle lentivirali. Titolazione con cellule HT1080 Titoli virali può essere calcolata utilizzando il kit globale SBI di Titolazione Ultrarapid secondo le istruzioni del produttore. Questo sistema utilizza qPCR per misurare l'integrazione della sequenza virale WPRE dal vettore lentivirale in HT1080 cellule e lo confronta con una curva standard, sulla base di una sequenza genomica di riferimento per misurare accuratamente unità infettive per ml (Figura 4). Trasduzione delle cellule bersaglio Se si utilizza particelle lentivirali che esprimono un marcatore GFP costitutivamente attiva, le cellule GFP positive iniziative dovrebbe prendere forma entro 12-24 ore di trasduzione, se la reazione di trasduzione sta lavorando. Espressione di GFP dovrebbe continuare anche dopo il costrutto lentivirale integra stabilmente in tegli ospitare genoma della cellula. Se trasduzione con MOI differenti, la fluorescenza GFP dovrebbe corrispondere approssimativamente la MOI, in cui MOI bassi mostrano fluorescenza GFP inferiore e superiore MOI mostrano un aumento di fluorescenza GFP (Figura 5). Figura 1. Panoramica del disciplinare di produzione virale. I plasmidi di confezionamento lentivector e PPACK vengono mescolati e co-transfettato in cellule 293TN. Dopo 48 -72 ore, il surnatante virale viene raccolto, e le particelle virali vengono fatte precipitare con PEG-esso. Dopo la titolazione delle particelle lentivirali, possono essere utilizzati per trasdurre celle di destinazione d'interesse. Clicca qui per ingrandire la figura . Figura 2. Contrasto di fase di cellule 293TN. Cella Density deve essere compresa tra 60-80% confluenti il ​​giorno di trasfezione. Figura 3. Immagine fluorescente di cellule GFP-positive 293TN 24 ore dopo la trasfezione con Purefection, pPACKH1, e un lentivector codifica GFP costrutto. Figura 4. Risultati qPCR WPRE e la curva standard ottenuta utilizzando il kit globale SBI di Titolazione Ultrarapid per calcolare MOI e titolo corrispondente confezionati particelle virali. Immagini di Figura 5. Fluorescenti di HT1080 cellule trasdotte con quantità crescenti di lentivirus. Le immagini sono da 72 ore dopo la trasduzione.