Embalagem HIV-FIV ou à base de construções de expressão e Lentivector Transdução de Partículas Pseudotyped VSV-G virais

1. Transfecção de células 293TN com plasmídeos de empacotamento e a construção de expressão Semente 7,0-8,0 x 10 6 293TN células por placa de cultura de 15 centímetros 2 em 20 ml de meio de cultura contendo meio DMEM suplementado com 4 mM L-glutamina, 4,5 g de glicose / l, e soro fetal de bovino (10%) sem antibióticos. Crescer durante 18-24 horas a 37 ° C com 5% de CO 2, de modo que a densidade celular alcança 60-80% de confluência no momento da transfecção. Em alguns casos, pode ser necessário para placas de semente várias das células para se obter um título suficientemente elevado para a transdução de células alvo. Para cada placa de células, adicionar 1,6 ml de DMEM isento de soro para um tubo de 2 ml autoclavado Eppendorff. Adicionar 45 mg pPACKH1 ou pPACKF1 e 4,5 ul de seu lentivector construir o DMEM e misture pipetando para cima e para baixo. Adicionar 55 ul de PureFection no mesmo tubo. Vortex durante 10 segundos. Incubar a DMEM-PureFection Plasmid-mistura em temperatura ambiente fou 15 min. Adicione o DMEM-PureFection Plasmid-mistura para a placa de cultura de tecido, gota a gota e agite cuidadosamente para dispersar uniformemente em todo o prato. Retornar o prato para a incubadora e crescer a 37 ° C com 5% de CO 2. Não há necessidade de alterar o suporte após a transfecção. Se a sua construção lentivector expressa um gene que codifica uma proteína fluorescente como GFP, verificar as suas células sob um microscópio de 12-24 horas após a transfecção. Deverá ser capaz de ver> células 90% GFP-positiva, indicando que a transfecção foi bem sucedida. Recolher o sobrenadante da cultura celular após 48 e 72 horas em um tubo de centrífuga de 50 ml estéril. Este sobrenadante da cultura celular agora contém partículas infecciosas pseudoviral. (Seguir as orientações recomendadas para trabalhar com NBS-2 classe de segurança.) Centrifugar a 1.500 xg durante 15 min à temperatura ambiente para sedimentar os detritos celulares. Transferir o sobrenadante viral para um novo tubo, assegurando para não perturbar o sedimento. Células 293TN que têm sido utilizados para a embalagem viral devem ser eliminados de um recipiente de risco biológico e não são para ser utilizado para outras rondas de embalagem viral. 2. Concentração do sobrenadante viral Adicionar 1 volume de frio (4 ° C) de PEG-se da solução de precipitação de vírus a cada 4 volumes de sobrenadante de partícula contendo lentiviral. Precipitação de partículas lentivirais de grandes volumes pode ser conseguido com Corning 250 ml tubos de centrífuga de polipropileno. Misturar a solução por vezes invertendo os vários tubos, mas não vórtice da mistura. A solução no frigorífico a 4 ° C durante pelo menos 12 horas (até 4 dias é aceitável). Não agitar ou girar os tubos durante a etapa de refrigeração. Centrifugar a mistura / PEG-se o sobrenadante a 1.500 xg durante 30 minutos a 4 ° C. Após centrifugação, as partículas lentivirais aparecerá como um bege ou pelete branco no fundo do tubo. Despeje a supernatant. Remova todos os vestígios de fluidos por aspiração, tomando cuidado para não perturbar as partículas precipitadas lentivirais no sedimento. Vestígios de residual de PEG-vai diluir o vírus (reduzindo assim a titulação), mas não vai afectar a integridade das células alvo desde PEG-é inerte e não tóxico. Ressuspender e combinar as partículas lentivirais em 1/100 do volume original usando frio (4 ° C), fosfato estéril ou solução salina tamponada com DMEM contendo 25 mM de tampão HEPES. Alíquota em frascos estéreis criogénicos e armazenar a -70 ° C até estar pronto para utilização. 3. A titulação viral e Transdução de células-alvo Sugerimos titulação das partículas de lentivirais antes transduzir células alvo de interesse e calculando a multiplicidade apropriado de infecção (MOI) para as células-alvo para a consistência entre experiências. Para titulação viral, recomendamos o uso de células HT1080 como uma linha de controle fácil de infectar positivo. Plfacilidade notar que o protocolo de titulação envolve transduzir células HT1080 com uma pequena alíquota das partículas lentivirais tiver embalados. Uma vez que o título é conhecido, as células-alvo de interesse também podem ser transduzidas com as partículas produzidas lentivirais. Um protocolo de titulação recomendo pode ser encontrado em: http://www.systembio.com/downloads/manual_titer_kit_web.pdf 7. Placa de 50.000 células-alvo de interesse por poço numa placa de 24 poços em meios de cultura de células. Utilize os meios de comunicação que as células são normalmente cultivadas dentro crescer as células durante a noite em suas condições de cultura especificadas. Células deve ser entre 50 a 70% confluentes no dia da transdução. No dia da transdução, aspirar os meios de comunicação das células. Combinar meio de cultura com TransDux a uma concentração final de 1 x (por exemplo, 2,5 TransDux uL a 500 uL de meio de cultura). Em seguida, transferir o TransDux-cemistura médio ll cultura a cada poço. Pipetar o volume apropriado de vírus que corresponde ao óptimo MOI para as células-alvo em cada poço. Se o MOI óptima é desconhecida, é recomendável tentar uma gama de MOIs diferentes (tal como um MOI de 1, 2 e 5, para fácil de infectar as células de cultura de tecidos, e uma MOI de 1, 10 e 20 para mais difícil -infectar as células primárias). Se a concentração das partículas lentivirais não é conhecido (tal como determinado através de um protocolo de titulação do vírus), diferentes volumes de vírus pode ser tentado, tal como 1, 2 e 5 ul de vírus. O vírus pode permanecer em contacto com as células-alvo por até 72 horas. Outras experiências com a células transduzidas de interesse-alvo pode ser iniciado 72 horas após a transdução, uma vez que o construto viral tem integrado no genoma da célula hospedeira. Alterar a médio e passagem a células alvo de interesse de acordo com suas necessidades específicas. 4. Os resultados representativos <pclass = "jove_step" transfecção> de células 293TN A densidade de partida das células 293TN é crítica para a embalagem viral bem sucedida. Células 293TN deve estar entre 60 -80% confluentes no dia da transfecção (Figura 2). Se as células 293TN são menos do que 60% confluentes, permitir-lhes a crescer durante mais algumas horas antes de se tentar a transfecção. Se as células são 293TN> confluente a 80%, eles devem ser replated antes da transfecção. Se usando um GFP lentivector expressando, pelo menos 90% das células 293TN deve fluorescência verde 24 horas após a transfecção, indicando uma transfecção bem sucedida (Figura 3). Se menos de 90% das células são GFP-positiva, não se prosseguir para o passo seguinte, porque isso indica que a transfecção não foi bem sucedida, e os títulos virais será baixa. Em vez disso, placas novas células 293TN e começar de novo, certificando-se que as células 293TN estão na densidade celular adequada antes da transfecção. Células 293TN podem retirar as placas de cultura de tecidos de 48-72 horas após a transfecção. Isso não afeta negativamente a produção de partículas lentivirais. Titulação com células HT1080 Os títulos virais pode ser calculada usando o kit da SBI titulação global ultra-rápida de acordo com as instruções do fabricante. Este sistema utiliza qPCR para medir a integração virai da sequência WPRE a partir do vector lentiviral em células HT1080 e compara esta com uma curva padrão, com base numa sequência de referência genómico para medir com precisão unidades infecciosas por ml (Figura 4). Transdução de células alvo Se o uso de partículas lentivirais que expressam um marcador GFP constitutivamente activa, células GFP positivas devem começam a aparecer dentro de 12-24 horas de transdução, se a reacção de transdução está a funcionar. Expressão GFP deve continuar após a construção lentiviral estavelmente integra-se tele hospedar genoma da célula. Se transdução com MOIs diferentes, a fluorescência da GFP deve coincidir com a aproximadamente MOI, em que MOI baixas mostram fluorescência menos GFP e MOIs superiores mostram aumento GFP de fluorescência (Figura 5). Figura 1. Visão geral do protocolo de produção viral. Os plasmídeos de empacotamento lentivector e PPACK são misturados e co-transfectados em células 293TN. Depois de 48 -72 horas, o sobrenadante viral é recolhido, e partículas virais são precipitadas com PEG-lo. Após titulação das partículas de lentivirais, eles podem ser usados ​​para transduzir células-alvo de interesse. para ver figura maior . Figura 2. Imagem de contraste de fase das células 293TN. Densit celulary deverá estar entre 60-80% confluentes no dia da transfecção. Figura 3. Imagem fluorescente de células GFP positivas 293TN 24 horas após a transfecção com Purefection, pPACKH1, e uma codificação de GFP lentivector construto. Figura 4. Resultados qPCR WPRE e curva padrão obtida usando o kit da SBI titulação global ultra-rápida para calcular MOI e titulação correspondente de embalados partículas virais. Figura 5. Imagens fluorescentes das células HT1080 transduzidas com quantidades crescentes de lentivírus. As imagens são de 72 horas pós-transdução.