Un enfoque estándar para preparar a los adultos<em> Drosophila</em> Los ojos de semi-fino corte y el análisis al microscopio óptico se presenta aquí. El protocolo se puede utilizar para el análisis morfológico de los defectos del ojo, o con los ajustes indicados se puede utilizar para determinar los requerimientos de genética de genes en tipos celulares específicos del ojo (por ejemplo, análisis clonal de los fotorreceptores) o para el análisis de microscopia electrónica.
Drosophila ha sido utilizado como sistema modelo para estudiar el desarrollo, principalmente debido a la facilidad con que es manejable de forma genética. Con los años, una gran cantidad de cepas mutantes y trucos técnicos se han desarrollado para permitir a las preguntas sofisticado para ser formuladas y contestadas en un plazo razonable de tiempo. Idea fundamental en la interacción de los componentes de todas las conocidas vías principales de señalización que se haya obtenido en avance y retroceso de los estudios genéticos Drosophila. El ojo de la mosca ha demostrado ser excepcionalmente adecuado para el análisis de las mutaciones, ya que, en condiciones de laboratorio, las moscas pueden sobrevivir sin los ojos funcionales. Además, la superficie del ojo de un insecto se compone de alrededor de 800 ojos de cada unidad (o facetas omatidios) que forman una superficie regular, lisa cuando se observan bajo un microscopio de disección. Por lo tanto, es fácil ver si una mutación podría afectar el desarrollo del ojo o el crecimiento por el exterior en busca de la pérdida de la superficie lisa (fenotipo "ojo áspera; Fig. 1.) O el tamaño total del ojo, respectivamente (para ver ejemplos de pantallas basadas en la morfología externa del ojo ver, por ejemplo 1). Posterior análisis detallado de los fenotipos de los ojos requieren la fijación, la incorporación de plástico y delgado corte de los ojos de un adulto.
El ojo de Drosophila se desarrolla desde el disco de los ojos llamada imaginal, una bolsa de las células epiteliales que proliferan y se diferencian en las etapas de larva y pupa (para revisión ver por ejemplo 2). Cada ommatidio consta de 20 células, entre ellas ocho fotorreceptores (las células de relaciones públicas o R;. Fig. 2), cuatro secreción de lentes células conos, células pigmentadas ("hexágono" en torno a R en células de racimo) y una cerda. Los fotorreceptores de cada ommatidio, más fáciles de identificar por sus orgánulos sensibles a la luz, el rhabdomeres, se organizan en un trapecio formado por los seis "de afuera" (R1-6) y dos "interior" fotorreceptores (R7 / 8; R8 [Fig. . 2] se encuentra debajo de R7 y por lo tanto sólo se ve en las secciones de las zonas más profundas del ojo). El trapecio de cada faceta es precisamente alineados con los de sus vecinos y los ejes anteroposterior y dorsoventral general del ojo (Fig. 3). En particular, el omatidios de la dorsal y ventral (flechas de color negro y rojo, respectivamente) mitades de los ojos son imágenes especulares uno del otro y se corresponden con dos formas quirales de señalización establecidos en la polaridad celular plana (para una revisión véase, por ejemplo 3).
El método para generar semi-delgadas secciones de los ojos (como los presentados en la Fig. 3). Describe aquí es ligeramente modificada de la que inicialmente se describió por Tomlinson y Ready 4. Permite el análisis morfológico de todas las células, excepto para las células cono transparente. Además, el pigmento de las células de R-(puntas de flecha azul en la figura. 2 y 3) se puede utilizar como un marcador de células autónomas para el genotipo de un R-célula, por lo tanto las necesidades genéticas de los genes en un subconjunto de R-células pueden fácilmente se determinará 5,6.
Con Drosophila como organismo modelo, las pantallas de genética llevó a la identificación de muchos de los miembros fundadores de familias de genes esenciales para la mayoría de las vías de señalización altamente conservados en eucariotas superiores incluidos los seres humanos. Ya que, en condiciones de laboratorio, un ojo funcional es prescindible para la supervivencia, el ojo es un tejido especialmente adecuado para el descubrimiento de las funciones de genes nuevos y la evaluación de las redes genéticas. El análisis ultraestructural del ojo de la mosca utilizando el método descrito así a los descubrimientos fundamentales relevantes para el desarrollo y la enfermedad. Inicialmente, el análisis clonal de células individuales se realizó a través de rayos X combinada con clones inducidos por conocidos estrechamente asociado células autónomas marcadores recesivos. Más recientemente, la disponibilidad del sistema de FLP / FRT para generar clones ha facilitado enormemente el análisis fenotípico de las mutaciones letales en 6,9 secciones ojo.
El análisis de las secciones del ojo no se limita a los cortes tangenciales se describe aquí. Si lo desea, los jefes pueden ser alineados en cualquier orientación en los moldes y las secciones transversales se pueden obtener para estudiar las capas más profundas en la cabeza, como la lámina y la médula. El protocolo se describe aquí es, pues, un método versátil para el análisis de las estructuras de los adultos los ojos y la cabeza de Drosophila.
The authors have nothing to disclose.
Me gustaría agradecer a la Dra. Jennifer Curtiss de las imágenes de la figura. 1 y Jeremy Fagan y el Dr. Florencia Marlow para la lectura crítica del manuscrito. Nuestro trabajo es apoyado por el NIH subvención 1R01GM088202.
General equipment:
Fixation solutions:
Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette.
Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use.
Staining solution:
1% Toluidine-blue in 1% Borax.
Soft | Hard | |
---|---|---|
Resin A | 54g | 50g |
Hardener B | 44.5g | 50g |
Accelerator C | 2.5g | 1.75g |
Plasticizer D | 10g | 0.75g |
Table 1. Resin preparation
To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol.
Reagent | Supplier | Catalog number |
---|---|---|
Fly pad | e.g. Genesee | 59-119 |
Glutaraldehyde | Sigma | G7526-10 X 10 ML |
OsO4 | Polysciences,Inc. | 0972A-20 |
Propyleneoxide | Fisher | 04332-1 |
Scalpel handles, for #3 | Fisher | 22080046 |
Scalpel blades #11 | Fisher | 08-916-5B |
Transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M |
Durcupan (R) ACM resin | Sigma (Fluka) | 44610-1EA |
Steel dissecting needle | Fisher | S17346 |
BEEM flat embedding mold | Electron Microscopy Sci. | 70904-12 |
Teflon coated razor blades | Electron Microscopy Sci. | 71970 |
Q-tip (sterile swabs) | Fisher | 14-959-81 |
Glass slides | Fisher | 12-550-143 |
Cover slips No 1, 22X60 mm | Fisher | 12-531K |
Gelatin | Fisher | ICN96010280 |
Cr(III) K SO4 dodecahydrate | Sigma | 243361 |
Diamond Histo knife, 6mm | Diatome US | 60-His |
Toluidine Blue O | Fisher | BP107-10 |
Borax (Na-Tetraborate) | Fisher | AC20629-1000 |
DPX mounting medium | Sigma | 44581-100ML |
Table 2. Materials