Yetişkin hazırlanması Drosophila Gözler İnce Kesit ve Mikroskobik Analizi
Summary
Yetişkin hazırlamak için standart bir yaklaşım<em> Drosophila</em> Gözleri yarı-ince kesit ve ışık mikroskobik inceleme için burada sunulmuştur. Göz kusurları brüt morfolojik analizi için kullanılan protokol, ya da belirtilen ayarlamaları ile, göz belirli hücre tipleri (örneğin fotoreseptörlerin klonal analizi) veya elektron mikroskobik analizi için genlerin genetik gereksinimlerini belirlemek için kullanılabilir.
Abstract
Drosophila uzun genetik uysal olduğu kolaylığı nedeniyle, geliştirme çalışma modeli bir sistem olarak kullanılır olmuştur. Yıllar geçtikçe, mutant bir bolluk ve teknik hileler sofistike sorulan sorular ve makul bir zaman içinde cevaplanması gereken izin vermek için geliştirilmiştir. Temel fikir, bilinen tüm önemli sinyal yolakları bileşenlerinin etkileşim içine ileriye doğru elde edilen ve genetik Drosophila çalışmalar ters olmuştur. Laboratuvar koşullarında, sinekler fonksiyonel gözleri olmadan hayatta kalabilir, çünkü sinek göz, son derece iyi mutasyon analizi için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca, böcek göz yüzeyinde bir diseksiyon mikroskop altında bakıldığında düzenli, düzgün bir yüzey oluşturan yaklaşık 800 ayrı ünitesi gözleri (yönü veya ommatidia) oluşmaktadır. Sırasıyla veya genel göz boyutu, (ekranlar dayalı örnekler için; Böylece, bir mutasyon, dışarıdan pürüzsüz bir yüzey kaybı (Şekil 1 'kaba göz' fenotip) bakarak göz gelişimi ve büyümeyi etkileyebilecek olup olmadığını görmek için kolaydır dış göz morfoloji) örneğin 1. Göz fenotipleri sonraki detaylı analizler fiksasyon, plastik gömme ve yetişkin gözleri ince kesit gerektirir.
Drosophila göz sözde göz hayali disk, (inceleme için örneğin 2) larva ve pupa aşamalarında çoğalırlar ve ayırt epitel hücrelerinin bir çanta geliştirir. Dört lens salgılayan koni hücreleri, pigment hücreleri (R-hücre küme etrafında 'altıgen) ve kıl; Her ommatidium sekiz fotoreseptör (Şekil 2 PR veya R-hücreler) olmak üzere toplam 20 hücrelerinden oluşur. R8 [Şek, en kolay, ışığa duyarlı organelleri rhabdomeres (R1-6) altı "dış" ve iki "iç" fotoreseptör (R7 / 8 oluşan bir yamuk düzenlenen her ommatidium fotoreseptörlerin tespit 2]) R7 altında ve bu nedenle sadece göz derin alanlardan bölümlerinde görülmektedir. Her faset yamuk komşuları ve göz (Şekil 3A) genel bir ön-arka ve dorsoventral eksenleri ile tam uyumludur. Özellikle, dorsal ve ventral (sırasıyla siyah ve kırmızı oklar) ommatidia göz yarıları birbirlerinin ayna görüntüsü ve düzlemsel hücre polaritesi sinyalizasyon (inceleme için bakınız örneğin 3) sırasında kurulan iki kiral biçimlerine karşılık gelir.
Burada anlatılan yöntemi (Şekil 3 sunulan bu gibi) yarı-ince göz bölümleri oluşturmak için başlangıçta Tomlinson ve 4 Hazır açıklanan biraz değiştirilmiş. Şeffaf koni hücreleri hariç tüm hücrelerin morfolojik analiz sağlar. Buna ek olarak, Ar-hücrelerinin (mavi ok uçları Şekil 2 ve 3), pigment genotip bir R-hücre için bir hücre özerk işaretleyici, böylece genlerin genetik gereksinimlerini Ar-hücrelerinin bir alt kümesi olarak kullanılabilir kolayca 5,6 belirlenir.
Protocol
Discussion
Drosophila model organizma, insanlar da dahil olmak üzere yüksek ökaryotlarda yüksek derecede korunmuş sinyal yollarının en önemli gen ailelerinin kurucu üyelerinden birçok tanımlanmasına yol açan genetik ekranları gibi kullanma. Laboratuvar koşullarında hayatta kalmak için, fonksiyonel bir gözle vazgeçilebilir olduğu için, göz, yeni genlerin fonksiyonlarının keşfi ve genetik ağlarının değerlendirilmesi için özellikle uygundur doku. Böylece açıklanan yöntemi kullanarak sinek göz ultrastrüktürel analizi geliştirme ve hastalık ile ilgili temel keşiflere yol açtı. Başlangıçta tek bir hücre klonal analiz bilinen yakından ilişkili hücre özerk resesif belirteçler ile birlikte X-ışını indüklenen klonlar kullanılarak gerçekleştirildi. Daha yakın zamanlarda, klonlar oluşturmak için FLP / FRT sistemin durumu büyük ölçüde göz bölümleri 6,9 ölümcül mutasyonlar fenotipik analizi kolaylaştırmıştır .
Burada açıklanan teğet bölümlerine göz bölümden Analizi sınırlı değildir. İsterseniz, kafaları kalıplarda herhangi bir yönde uyumlu hale getirilmesi ve enine bölümler lamina ve medulla gibi kafasında derin katmanları çalışma elde edilebilir. Burada açıklanan protokol bu nedenle göz ve kafa yapıları Drosophila yetişkin analizleri için çok yönlü bir yöntemdir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Jennifer Curtiss Şekil resimler için teşekkür etmek istiyorum. 1 ve Jeremy Fagan ve Floransa Marlow eleştirel bir yazının okunması için Dr. Çalışmalarımız NIH hibe 1R01GM088202 tarafından desteklenmektedir.
Materials
General equipment:
- For general fly husbandry see 10
- Standard dissection microscope (e.g. Nikon SMZ-645 Stereo Zoom Microscope), preferably with a ring light source to prevent casting a shadow of your hands.
- CO2 Fly pad, covered with 3MM Whatman paper to provide protection against dirt during dissection.
- Gelatin coated slides: dissolve 10g gelatin and 1g CrKSO4x 12 H2O in 1L water on a heating plate (bring almost to a boil, takes approximately 2 hrs). Dip well washed (soap) and rinsed (dH2O) slides in holders into gelatin solution and air-dry covered with foil overnight.
- Heating oven (70°C; old vacuum ovens that were used for nitrocellulose filter drying are well suited for this purpose).
- Microtome capable of ultrathin sectioning (0.5-1 μm thick sections), e.g. those used by electron microscopy facilities. We use a Sorvall MT5000 Ultramicrotome with a Histo quality diamond knife. Glass knives also work.
Fixation solutions:
- Prepare a stock solution of 0.2 M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2.
- Prepare 2% glutaraldehyde in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2 (can be stored at 4°C for 4 weeks). Make at least enough to have 200μl per genotype you want to embed. Keep on ice.
- Osmium solution: 2% OsO4 in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2. Make only enough to have 200μl per genotype you want to embed, since the solution cannot be stored. Keep on ice.
Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette.
Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use.
Staining solution:
1% Toluidine-blue in 1% Borax.
| Soft | Hard | |
|---|---|---|
| Resin A | 54g | 50g |
| Hardener B | 44.5g | 50g |
| Accelerator C | 2.5g | 1.75g |
| Plasticizer D | 10g | 0.75g |
Table 1. Resin preparation
To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol.
| Reagent | Supplier | Catalog number |
|---|---|---|
| Fly pad | e.g. Genesee | 59-119 |
| Glutaraldehyde | Sigma | G7526-10 X 10 ML |
| OsO4 | Polysciences,Inc. | 0972A-20 |
| Propyleneoxide | Fisher | 04332-1 |
| Scalpel handles, for #3 | Fisher | 22080046 |
| Scalpel blades #11 | Fisher | 08-916-5B |
| Transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M |
| Durcupan (R) ACM resin | Sigma (Fluka) | 44610-1EA |
| Steel dissecting needle | Fisher | S17346 |
| BEEM flat embedding mold | Electron Microscopy Sci. | 70904-12 |
| Teflon coated razor blades | Electron Microscopy Sci. | 71970 |
| Q-tip (sterile swabs) | Fisher | 14-959-81 |
| Glass slides | Fisher | 12-550-143 |
| Cover slips No 1, 22X60 mm | Fisher | 12-531K |
| Gelatin | Fisher | ICN96010280 |
| Cr(III) K SO4 dodecahydrate | Sigma | 243361 |
| Diamond Histo knife, 6mm | Diatome US | 60-His |
| Toluidine Blue O | Fisher | BP107-10 |
| Borax (Na-Tetraborate) | Fisher | AC20629-1000 |
| DPX mounting medium | Sigma | 44581-100ML |
Table 2. Materials
References
- Harvey, K. F., Pfleger, C. M., Hariharan, I. K. The Drosophila Mst ortholog, hippo, restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis. Cell. 114, 457-457 (2003).
- Secombe, J., Li, L., Carlos, L., Eisenman, R. N. The Trithorax group protein Lid is a trimethyl histone H3K4 demethylase required for dMyc-induced cell growth. Genes Dev. 21, 537-537 (2007).
- Cagan, R. Principles of Drosophila eye differentiation. Curr Top Dev Biol. 89, 115-115 (2009).
- Jenny, A. Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye. Curr Top Dev Biol. 93, 189-189 (2010).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Cell fate in the Drosophila Ommatidium. Dev. Biol. 123, 264-264 (1987).
- Tomlinson, A., Ready, D. F. Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium. Dev. Biol. 120, 366-366 (1987).
- Jenny, A., Darken, R. S., Wilson, P. A., Mlodzik, M. Prickle and Strabismus form a functional complex to generate a correct axis during planar cell polarity signaling. Embo J. 22, 4409-4409 (2003).
- Zheng, L., Zhang, J., Carthew, R. W. frizzled regulates mirror-symmetric pattern formation in the Drosophila eye. Development. 121, 3045-3045 (1995).
- Reinke, R., Zipursky, S. L. Cell-cell interaction in the Drosophila Retina: The bride of sevenless Gene is required in photoreceptor cell R8 for R7 cell development. Cell. 55, 321-321 (1988).
- Wolff, T., Rubin, G. M. strabismus, a novel gene that regulates tissue polarity and cell fate decisions in Drosophila. Development. 125, 1149-1149 (1998).
- Winter, C. G. Drosophila Rho-associated kinase (Drok) links Frizzled-mediated planar cell polarity signaling to the actin cytoskeleton. Cell. 105, 81-81 (2001).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1223 (1993).
- Stocker, H., Gallant, P., Dahmann, C. . Methods Mol Biol. 420, 27-27 (2008).
