הגישה הסטנדרטית כדי להכין את הבוגרים<em> תסיסנית</em> עיניים חתך חצי דקה ניתוח מיקרוסקופי אור מוצג כאן. הפרוטוקול ניתן להשתמש לצורך ניתוח מורפולוגי ברוטו של פגמים העין, או עם התאמות ציינו שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע דרישות הגנטי של הגנים סוגי תאים מסוימים של העין (ניתוח למשל המשובטים של קולטני האור) או לצורך ניתוח מיקרוסקופי אלקטרונים.
תסיסנית כבר זמן רב המשמש כמערכת מודל מחקר ופיתוח, בעיקר בשל הקלות שבה הוא ממושמע מבחינה גנטית. במהלך השנים, שפע של זנים מוטנטים וטריקים טכני פותחו כדי לאפשר שאלות מתוחכמות להישאל וענה בסכום זמן סביר. התובנה הבסיסית לתוך הגומלין של המרכיבים של כל המסלולים העיקריים ידוע איתות התקבל ב קדימה הפוכה מחקרים גנטיים תסיסנית. העין לטוס הוכיחה להיות מתאים במיוחד גם עבור ניתוח מוטציוני, שכן, בתנאי מעבדה, זבובים יכולים לשרוד בלי עיניים תפקודית. יתר על כן, פני השטח של העין חרק מורכב כ -800 עיניים יחידת הפרט (היבטים או האומטידיה) היוצרים משטח רגיל, כאשר חלקה הסתכל תחת מיקרוסקופ לנתח. לכן, קל לראות אם מוטציה עשויה להשפיע על התפתחות העין או על ידי צמיחה חיצונית מחפש אובדן השטח החלקים (פנוטיפ "עין גס"; איור 1.) או גודל העין הכללית, בהתאמה (עבור דוגמאות של המסכים המבוססים על מורפולוגיה עין חיצונית לראות למשל 1). לאחר ניתוחים מפורטים של פנוטיפים עין דורשים, קיבעון הטבעה פלסטיק דק חתך של העיניים הבוגרת.
העין תסיסנית מפתחת מדיסק שנקרא עין דמותי, שקית לתאי האפיתל כי להתרבות להבדיל בשלבי הזחל ו גלמי (לסקירה ראה 2 למשל). כל אומטידיום מורכב 20 תאים, כולל שמונה photoreceptors (PR או R-תאים;. איור 2), ארבע עדשות מפריש תאים חרוט, תאים פיגמנט ("משושה" סביב מקבץ תאים R) וכן זיפים. Photoreceptors של אומטידיום כל, הכי מזוהה בקלות על ידי אברונים רגישים לאור שלהם, rhabdomeres, מאורגנים טרפז מורכב ששת "החיצוני" (R1-6) ושני "פנימי" photoreceptors (R7 / 8; R8 [איור . 2] מתחת R7 ולכן ראיתי רק בחלקים מאזורים עמוקים יותר של העין). טרפז של פן כל מיושרים במדויק עם אלה של שכנותיה הצירים anteroposterior ו dorsoventral הכוללת של העין (איור 3A). בפרט, האומטידיה של (חיצים שחורים ואדומים, בהתאמה) הגבי ו הגחון חצאים של העין הם תמונות ראי של אחד את השני מתאימות שתי צורות כיראלי הוקמה במהלך איתות הקוטביות מישוריים תא (לסקירה ראו למשל 3).
השיטה לייצר חצי דקה סעיפים העין (כמו אלה שהוצגו באיור. 3) המתואר כאן הוא שונה במקצת מזו המתוארת במקור על ידי טומלינסון ו Ready 4. זה מאפשר ניתוח מורפולוגי של כל התאים פרט לתאי חרוט שקוף. בנוסף, פיגמנט של R-תאים (ראשי חץ כחול באיור. 2 ו -3) יכול לשמש כסמן התא אוטונומי עבור גנוטיפ של תא-R, דרישות הגנטי ובכך הגנים משנה של R-תאים יכולים בנקל ייקבע 5,6.
שימוש תסיסנית כאורגניזם מודל, מסכי הגנטי הוביל לזיהוי של רבים מן החברים המייסדים של משפחות גנים חיוניים ביותר של מסלולי איתות שמור ביותר אאוקריוטים גבוה כולל בני אדם. מאז, בתנאי מעבדה, עין פונקציונלי הוא לוותר להישרדות, העין היא רקמה במיוחד גם מתאים הגילוי של פונקציות גן הרומן ההערכה של רשתות גנטיות. ניתוח Ultrastructural העין לטוס באמצעות השיטה המתוארת ובכך הובילו תגליות בסיסיות הרלוונטיות לפיתוח המחלה. בתחילה, ניתוח תא בודד המשובטים בוצעה באמצעות רנטגן שיבוטים המושרה בשילוב עם ידוע תאים אוטונומיים סמנים קשר הדוק רצסיבי. לאחרונה, את הזמינות של מערכת FLP / FRT כדי ליצור שיבוטים יש להקל במידה רבה את הניתוח פנוטיפי של מוטציות קטלניות בסעיפים 6,9 העין.
ניתוח סעיפים העין אינה מוגבלת סעיפים משיק המתואר כאן. אם תרצה, בראש ניתן ליישר בכיוון כלשהו בתוך תבניות וחתכים רוחביים ניתן להשיג ללמוד רבדים עמוקים יותר בראש כגון lamina ואת לשד. פרוטוקול המתואר כאן הוא אפוא בשיטה תכליתי עבור ניתוח עיניים וראש מבוגרים מבני תסיסנית.
The authors have nothing to disclose.
אני רוצה להודות ד"ר ג'ניפר קרטיס עבור התמונות איור. 1 וג'רמי פייגן וד"ר פלורנס מרלו עבור אנושות לקרוא את כתב היד. העבודה שלנו היא נתמכת על ידי NIH מענק 1R01GM088202.
General equipment:
Fixation solutions:
Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette.
Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use.
Staining solution:
1% Toluidine-blue in 1% Borax.
Soft | Hard | |
---|---|---|
Resin A | 54g | 50g |
Hardener B | 44.5g | 50g |
Accelerator C | 2.5g | 1.75g |
Plasticizer D | 10g | 0.75g |
Table 1. Resin preparation
To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol.
Reagent | Supplier | Catalog number |
---|---|---|
Fly pad | e.g. Genesee | 59-119 |
Glutaraldehyde | Sigma | G7526-10 X 10 ML |
OsO4 | Polysciences,Inc. | 0972A-20 |
Propyleneoxide | Fisher | 04332-1 |
Scalpel handles, for #3 | Fisher | 22080046 |
Scalpel blades #11 | Fisher | 08-916-5B |
Transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M |
Durcupan (R) ACM resin | Sigma (Fluka) | 44610-1EA |
Steel dissecting needle | Fisher | S17346 |
BEEM flat embedding mold | Electron Microscopy Sci. | 70904-12 |
Teflon coated razor blades | Electron Microscopy Sci. | 71970 |
Q-tip (sterile swabs) | Fisher | 14-959-81 |
Glass slides | Fisher | 12-550-143 |
Cover slips No 1, 22X60 mm | Fisher | 12-531K |
Gelatin | Fisher | ICN96010280 |
Cr(III) K SO4 dodecahydrate | Sigma | 243361 |
Diamond Histo knife, 6mm | Diatome US | 60-His |
Toluidine Blue O | Fisher | BP107-10 |
Borax (Na-Tetraborate) | Fisher | AC20629-1000 |
DPX mounting medium | Sigma | 44581-100ML |
Table 2. Materials