准备成人的标准方法<em>果蝇</em半薄切片,光镜下分析>的眼睛是在这里。该协议可用于眼部缺陷的形态分析总值,或可以用在眼睛特定的细胞类型(如光感受器的克隆分析)或电子显微镜分析,以确定基因的遗传要求与指示调整。
果蝇一直被用来作为模型系统,研究发展,主要是由于与它的基因听话的难易程度。多年来,众多的突变株和技术技巧已经制定,让复杂的问题要问,并在合理的时间内回答。到所有已知的主要信号转导通路的组成部分的相互作用的基本观点已得到正向和反向基因果蝇的研究。苍蝇的眼睛已被证明是非常好,适合突变分析,因为,在实验室条件下,苍蝇可以生存无功能的眼睛。此外,虫眼的表面是由一些个别单位800眼(面或小眼),形成了定期,表面光滑时,看着在解剖显微镜下。因此,很容易看到是否突变可能会影响眼睛发育或外部表面光滑的损失(“粗糙眼”的表型;图1)。增长或整体眼睛的大小,分别为(基于屏幕的例子外眼形态, 例如 :1) 。随后的详细分析,眼表型需要固定,塑料包埋薄切片和成人的眼睛。
果蝇眼睛的发展,从所谓的眼成虫光盘,一包上皮细胞增殖,并在幼虫和蛹的阶段区分(审查, 如 2) 。每个ommatidium由20个细胞,其中包括8个光感受器(PR或R -细胞,图2),4个镜头分泌的视锥细胞,色素细胞(“六角”周围的R -细胞集群)和猪鬃。每个ommatidium的光感受器,最容易确定其对光敏感的细胞器,rhabdomeres,是一个梯形六“外”(R1 – 6)和两个“内在的”光感受器(R7 / 8举办R8 [图2]下面是R7的,因此只在更深的领域从眼球的部分)。每个面的梯形是其邻国和整体正位眼(图3A)和背腹轴的精确对准。特别是,背,腹(黑色和红色箭头,分别)半眼的小眼是互为镜像,对应在平面细胞极性的信号( 审查见如3)建立了两个手性形式。
这里描述的方法来生成半薄眼的部分(如在图3中提出的)从最初Tomlinson和准备 4描述的略有修改。它允许所有细胞的形态分析,除了透明的视锥细胞。此外,色素的R -细胞(蓝色箭头在图2和3)可以用来作为一个R -细胞的基因型的细胞自主的标志,在一个子集的R -细胞可以遗传的基因因此要求很容易地确定5,6。
用果蝇作为模式生物,导致遗传筛选确定的包括人类在内的高等真核生物中高度保守的信号途径所必需的基因家族的创始成员的许多。一直以来,在实验室条件下,功能的眼睛是为生存而可有可无,映入眼帘的是一个新基因功能的发现和基因网络的评估特别适合的组织。超微结构分析的飞眼睛使用的描述方法,从而导致发育和疾病相关的基本发现。最初,单细胞克隆进行分析,利用X射线诱导密切相关的隐性标记的细胞自治相结合,克隆项目。最近,产生克隆的FLP /首次登记税制度的可用性大大促进眼睛部分 6,9致死突变的表型分析。
眼睛部分的分析并不局限于这里所描述的切线节。如果需要的话,磁头可以在任何方向对准,在模具和横截面可研究在头层和髓质等深层。因此,这里所描述的协议是一个通用的方法对眼睛和头部结构果蝇成人的分析。
The authors have nothing to disclose.
我想感谢詹妮弗柯蒂斯博士在图图片。 1,批判性阅读的手稿杰里米费根博士和佛罗伦萨马洛。我们的工作是支持由NIH资助1R01GM088202。
General equipment:
Fixation solutions:
Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette.
Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use.
Staining solution:
1% Toluidine-blue in 1% Borax.
Soft | Hard | |
---|---|---|
Resin A | 54g | 50g |
Hardener B | 44.5g | 50g |
Accelerator C | 2.5g | 1.75g |
Plasticizer D | 10g | 0.75g |
Table 1. Resin preparation
To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol.
Reagent | Supplier | Catalog number |
---|---|---|
Fly pad | e.g. Genesee | 59-119 |
Glutaraldehyde | Sigma | G7526-10 X 10 ML |
OsO4 | Polysciences,Inc. | 0972A-20 |
Propyleneoxide | Fisher | 04332-1 |
Scalpel handles, for #3 | Fisher | 22080046 |
Scalpel blades #11 | Fisher | 08-916-5B |
Transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M |
Durcupan (R) ACM resin | Sigma (Fluka) | 44610-1EA |
Steel dissecting needle | Fisher | S17346 |
BEEM flat embedding mold | Electron Microscopy Sci. | 70904-12 |
Teflon coated razor blades | Electron Microscopy Sci. | 71970 |
Q-tip (sterile swabs) | Fisher | 14-959-81 |
Glass slides | Fisher | 12-550-143 |
Cover slips No 1, 22X60 mm | Fisher | 12-531K |
Gelatin | Fisher | ICN96010280 |
Cr(III) K SO4 dodecahydrate | Sigma | 243361 |
Diamond Histo knife, 6mm | Diatome US | 60-His |
Toluidine Blue O | Fisher | BP107-10 |
Borax (Na-Tetraborate) | Fisher | AC20629-1000 |
DPX mounting medium | Sigma | 44581-100ML |
Table 2. Materials