Une approche standard pour préparer les adultes<em> Drosophile</em> Les yeux pour les semi-minces et légers sectionnement analyse microscopique est présentée ici. Le protocole peut être utilisé pour l'analyse morphologique brut de défauts oculaires, ou avec les réglages indiqués peuvent être utilisées pour déterminer les exigences génétiques des gènes dans des types cellulaires spécifiques de l'œil (par exemple, l'analyse clonale des photorécepteurs) ou pour l'analyse microscopique des électrons.
Drosophile a longtemps été utilisé comme système modèle pour étudier le développement, principalement en raison de la facilité avec laquelle il est génétiquement maniable. Au fil des ans, une pléthore de souches mutantes et des astuces techniques ont été développées pour permettre à des questions complexes pour être posées et répondues dans un délai raisonnable. Aperçu fondamentaux dans le jeu de composants de toutes les voies de signalisation majeures connues a été obtenue en marche avant et arrière études génétiques chez la drosophile. L'œil de la mouche s'est avérée être exceptionnellement bien adapté pour l'analyse mutationnelle, puisque, dans des conditions de laboratoire, les mouches peuvent survivre sans les yeux fonctionnelle. Par ailleurs, la surface de l'œil des insectes est composé de quelque 800 yeux unité individuelle (facettes ou ommatidies) qui forment une base régulière, surface lisse quand on les regarde sous un microscope à dissection. Ainsi, il est facile de voir si une mutation pourrait affecter le développement des yeux ou de croissance externe par la recherche de la perte de la surface lisse («œil rugueux phénotype; Fig 1.) Ou la taille des yeux ensemble, respectivement (pour des exemples d'écrans basés sur la morphologie externe de l'œil voir par exemple 1). Après des analyses détaillées des phénotypes oculaires nécessitent une fixation, d'inclusion plastique et de fines coupes d'yeux d'adulte.
L'œil de drosophile se développe à partir du disque oeil dits imaginale, un sac de cellules épithéliales qui prolifèrent et se différencient au cours des stades larvaires et la nymphe (pour revue, voir deux, par exemple). Chaque ommatidie se compose de 20 cellules, dont huit photorécepteurs (PR ou R-cellules;. Fig 2), quatre cellules de cône cristallin sécrétant, les cellules pigmentaires ('hexagone "autour de R cellule cluster) et un poil. Les photorécepteurs de chaque ommatidie, plus facilement identifiés par leur lumière organites sensibles, le rhabdomeres, sont organisés dans un trapèze composée de six "extérieur" (R1-6) et deux "intérieure" photorécepteurs (R7 / 8; R8 [Fig 2.] est au-dessous R7 et donc seulement vu dans les sections à partir des zones plus profondes de l'œil). Le trapèze de chaque facette est précisément alignées sur celles de ses voisins et les axes antéropostérieur et dorsoventral globale de l'œil (figure 3A). En particulier, les ommatidies de la dorsale et ventrale (flèches noires et rouges, respectivement) moitiés de l'œil sont des images miroir les uns des autres et correspondent à deux formes chirales établi au cours de la signalisation cellulaire polarité planaire (pour revue, voir par exemple 3).
La méthode pour générer des sections oeil semi-fines (comme celles présentées dans la Fig. 3) décrit ici est légèrement modifiée de celle initialement décrite par Tomlinson et Ready 4. Il permet l'analyse morphologique de toutes les cellules sauf pour les cellules de cône transparent. De plus, le pigment de la R-cellules (flèches bleues sur la Fig. 2 et 3) peut être utilisé comme un marqueur de cellule autonome pour le génotype d'un R-cellulaires, les exigences ainsi génétique de gènes dans un sous-ensemble de R-cellules peuvent aisément être déterminée 5,6.
En utilisant la drosophile comme organisme modèle, cribles génétiques ont conduit à l'identification de la plupart des membres fondateurs de familles de gènes essentiels à la plupart des voies de signalisation hautement conservée chez les eucaryotes supérieurs, y compris les humains. Puisque, en vertu des conditions de laboratoire, un œil fonctionnel est dispensable pour la survie, l'oeil est un tissu particulièrement bien adapté pour la découverte des fonctions des gènes roman et l'évaluation des réseaux génétiques. Analyse ultrastructurale de l'œil de la mouche à l'aide de la méthode décrite ainsi conduit à des découvertes fondamentales pertinentes pour le développement et la maladie. Initialement, l'analyse seule cellule clonale a été réalisée à l'aide de rayons X induite combiné avec des clones connus étroitement associé cellulaire autonome marqueurs récessifs. Plus récemment, la disponibilité du système FLP / FRT pour générer des clones a grandement facilité l'analyse phénotypique de mutations létales dans les sections 6,9 oeil.
Analyse des sections œil n'est pas limité aux sections tangentielles décrites ici. Si désiré, les têtes peuvent être alignés dans n'importe quelle orientation dans les moules et les sections transversales peuvent être obtenus à l'étude des couches plus profondes dans la tête, comme la lame et la moelle. Le protocole décrit ici est donc une méthode polyvalente pour les analyses d'adultes tête et des yeux chez la drosophile structures.
The authors have nothing to disclose.
Je tiens à remercier le Dr Jennifer Curtiss pour les photos dans la Fig. 1 et Jeremy Fagan et Dr Florence Marlow pour la lecture critique du manuscrit. Notre travail est soutenu par NIH 1R01GM088202.
General equipment:
Fixation solutions:
Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette.
Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use.
Staining solution:
1% Toluidine-blue in 1% Borax.
Soft | Hard | |
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Resin A | 54g | 50g |
Hardener B | 44.5g | 50g |
Accelerator C | 2.5g | 1.75g |
Plasticizer D | 10g | 0.75g |
Table 1. Resin preparation
To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol.
Reagent | Supplier | Catalog number |
---|---|---|
Fly pad | e.g. Genesee | 59-119 |
Glutaraldehyde | Sigma | G7526-10 X 10 ML |
OsO4 | Polysciences,Inc. | 0972A-20 |
Propyleneoxide | Fisher | 04332-1 |
Scalpel handles, for #3 | Fisher | 22080046 |
Scalpel blades #11 | Fisher | 08-916-5B |
Transfer pipettes | Fisher | 13-711-7M |
Durcupan (R) ACM resin | Sigma (Fluka) | 44610-1EA |
Steel dissecting needle | Fisher | S17346 |
BEEM flat embedding mold | Electron Microscopy Sci. | 70904-12 |
Teflon coated razor blades | Electron Microscopy Sci. | 71970 |
Q-tip (sterile swabs) | Fisher | 14-959-81 |
Glass slides | Fisher | 12-550-143 |
Cover slips No 1, 22X60 mm | Fisher | 12-531K |
Gelatin | Fisher | ICN96010280 |
Cr(III) K SO4 dodecahydrate | Sigma | 243361 |
Diamond Histo knife, 6mm | Diatome US | 60-His |
Toluidine Blue O | Fisher | BP107-10 |
Borax (Na-Tetraborate) | Fisher | AC20629-1000 |
DPX mounting medium | Sigma | 44581-100ML |
Table 2. Materials