Retinale organoïden samenstellen met microglia
Özet
Microglia zijn unieke residente immuuncellen in het netvlies en spelen een cruciale rol bij verschillende degeneratieve ziekten van het netvlies. Het genereren van een co-cultuurmodel van retinale organoïden met microglia kan een beter begrip van de pathogenese en ontwikkelingsvoortgang van netvliesaandoeningen vergemakkelijken.
Abstract
Vanwege de beperkte toegankelijkheid van het menselijk netvlies zijn retinale organoïden (RO’s) het beste model voor het bestuderen van menselijke netvliesaandoeningen, die het mechanisme van netvliesontwikkeling en het optreden van netvliesaandoeningen zouden kunnen onthullen. Microglia (MG) zijn unieke residente macrofagen in het netvlies en het centrale zenuwstelsel (CZS), die cruciale immuniteitsfuncties vervullen. Retinale organoïden missen echter microglia, omdat hun differentiatieoorsprong de dooierzak is. De specifieke pathogenese van microglia bij deze netvliesaandoeningen blijft onduidelijk; Daarom blijkt het opzetten van een microglia-geïncorporeerd retinaal organoïdemodel noodzakelijk te zijn. Hier hebben we met succes een co-gekweekt model van retinale organoïden geconstrueerd met microglia afgeleid van menselijke stamcellen. In dit artikel hebben we microglia gedifferentieerd en vervolgens in een vroeg stadium samen gekweekt tot retinale organoïden. Als de incorporatie van immuuncellen biedt dit model een geoptimaliseerd platform voor modellering van netvliesaandoeningen en screening van geneesmiddelen om diepgaand onderzoek naar de pathogenese en behandeling van netvlies- en CZS-gerelateerde ziekten te vergemakkelijken.
Introduction
Als de beperkte bron van het menselijk netvlies, vertegenwoordigt de differentiatie van menselijke stamcellen in driedimensionale (3D) retinale organoïden een veelbelovend in vitro model voor het simuleren van het netvlies1. Het bevat verschillende celtypen in het netvlies, waaronder fotoreceptoren, retinale ganglioncellen, bipolaire cellen, Müller-cellen, horizontale cellen en astrocyten2. Dit model maakt de emulatie en studie mogelijk van zowel de mechanismen van de ontwikkeling van het netvlies als de pathogenese van netvliesaandoeningen. Vanwege de directionele differentiatiemethode werden retinale organoïden echter afgeleid van het neuro-ectoderm3, waarbij veel andere celtypen ontbraken die afkomstig waren van verschillende kiemlagen, zoals microglia uit de dooierzak en perivasculaire cellen uit het mesoderm 4,5,6.
Op dit moment is bewezen dat veel netvliesaandoeningen, zoals retinitis pigmentosa7, glaucoom8 en retinoblastoom9, nauw verwant zijn aan microglia in het netvlies. Door het ontbreken van goede onderzoeksmodellen blijven specifieke mechanismen die de relatie tussen microglia en deze ziekten illustreren echter nog steeds onduidelijk. Hoewel muizen hebben gediend als een gunstig model voor het bestuderen van netvliesaandoeningen, hebben recente studies significante verschillen aangetoond tussen muizen en menselijke microglia in termen van levensduur, proliferatiesnelheid en de afwezigheid van menselijke homologe genen10,11. Deze bevindingen suggereerden dat conclusies uit muismodellen mogelijk niet helemaal betrouwbaar zijn, wat het belang benadrukt van het construeren van menselijke retinale organoïden die microglia bevatten.
In de afgelopen decennia zijn er verschillende methoden ontwikkeld voor de 3D-differentiatie van retinale organoïden12,13. Om de co-cultuur van microglia in retinale organoïden te vergemakkelijken, hebben we gekozen voor een differentiatiemethode met een overgang van hechtende naar suspensiecultuur. Deze aanpak maakt het met succes mogelijk om microglia op te nemen in de organoïden van het netvlies, waardoor ze ten minste 60 dagen behoudenblijven14.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vanwege de beperkte beschikbaarheid van het menselijk netvlies is ons huidige begrip van ontstekingsreacties op het netvlies bijna afkomstig van diermodellen. Om deze beperking te overwinnen, werden retinale organoïden gedifferentieerd. De ontwikkeling van retinale organoïdemodellen is een actief onderzoeksgebied geweest, met als doel de complexiteit van het menselijk netvlies voor ziektemodellering en therapeutische ontwikkeling samen te vatten. Verschillende onderzoeken hebben gerapporteerd dat ze met succes retinale…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie wordt ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82101145) en de Beijing Natural Science Foundation (Z200014).
Materials
| Acctuase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| Advanced DMEM/F12 | Thermo | 12634-010 | |
| Anti-CRX(M02) | abnova | H00001406-M02 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| Anti-IBA1 | Abcam | ab5076 | Antibody; dilution as per the manufacturer's instructions |
| B27 | Life Technologies | 17105-041 | |
| Dispase (1U/mL) | Stemcell Technologies | 07923 | |
| DMEM basic | Gibco | 10566-016 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565-042 | |
| DPBS | Gibco | C141905005BT | |
| EDTA | Thermo | 15575020 | |
| F12 | Gibco | 11765-054 | |
| FBS | Biological Industry | 04-002-1A | |
| Gelatin | Sigma | G7041-100G | Solid |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| H9 cell line | WiCell Research Institute | ||
| IL-3 | RD Systems | 203-IL-050 | |
| IL-34 | PeproTech | 200-34-50UG | |
| KSR | Gibco | 10828028 | |
| Matrix | Corning | 356231 | |
| M-CSF | RD Systems | 216-MC-500 | |
| MEM Non-essential Amino Acid Solution | Sigma | M7145 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103-049 | |
| Pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Stem cell medium | Stemcell Technologies | 5990 | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| X-ViVO | LONZA | 04-418Q | |
| Y27632 | Selleck | S1049 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985-023 |
Referanslar
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).
- Zhang, X., Jin, Z. B. Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells. J Vis Exp. (170), e62298 (2021).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Kierdorf, K., et al. Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways. Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- O’koren, E. G., et al. Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration. Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).
- Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).
- Xu, J., et al. Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs. Glia. 72 (5), 872-884 (2024).
- Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science. 356 (6344), eaal3222 (2017).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
- Kim, S., et al. transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).
- Gao, M. L., et al. Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ. Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).
- Zhang, X., Jin, Z. B. Reconstruct human retinoblastoma in vitro. J Vis Exp. (188), e62629 (2022).
- Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
- Usui-Ouchi, A., et al. Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche. Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).
- Chichagova, V., et al. Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids. J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).
