İn vitro Simüle Edilmiş Gastrointestinal Sıvıların Çok Alt Fazlı Değişimi Yoluyla Emülsiyonların Tek Bir Damlacıkta Sindirimi

Emülsiyon sindirimini içeren yağın nasıl sindirildiğini anlamak, özelleştirilmiş işlevselliğe sahip ürünleri rasyonel olarak tasarlamak için önemlidir¹. Yağ sindirimi için substrat bir emülsiyondur, çünkü yağ mekanik etki ile tüketim üzerine emülsifiye edilir ve ağız ve midede biyosürfaktanlarla karıştırılır. Ayrıca, insanlar tarafından tüketilen yağın çoğu zaten emülsifiye edilmiştir (süt ürünleri gibi) ve bebekler veya bazı yaşlı insanlar söz konusu olduğunda, bu tek tüketim şeklidir. Bu nedenle, spesifik sindirim profillerine sahip emülsiyon bazlı ürünlerin tasarımı beslenmede çok önemlidir¹. Ayrıca, emülsiyonlar, obezite³, besin takviyesi, gıda alerjileri ve sindirim hastalıkları gibi farklı gastrointestinal durumlarla başa çıkmak için besinleri, ilaçları veya lipofilik biyoaktifleri^2’yi kapsülleyebilir ve verebilir. Sudaki yağ emülsiyonlarında, lipit damlacıkları proteinler, yüzey aktif maddeler, polimerler, parçacıklar ve karışımlar gibi emülgatörlerin ara yüzey katmanları ile çevrilidir⁴. Emülgatörlerin rolü iki yönlüdür: emülsiyon^5’i stabilize edin ve kapsüllenmiş bileşiği belirli bir bölgeye koruyun / taşıyın. Emülsiyonların özel bir sindirilebilirliğinin elde edilmesi, başlangıçtaki bileşimlerine bağlıdır, ancak aynı zamanda gastrointestinal sistemden geçiş sırasında bu arayüzün sürekli evriminin izlenmesini gerektirir (Şekil 1).

Şekil 1: Bazı ana gastrointestinal durumlarla başa çıkmak için emülsiyonların ara yüzey mühendisliğinin uygulanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Lipid sindirimi nihayetinde bir ara yüz işlemidir, çünkü lipazların (gastrik veya pankreas) emülsifiye lipit damlacıklarının yağ-su arayüzüne ara yüzey tabakasından adsorpsiyonunu gerektirir, böylece yağda bulunan trigliseritlere serbest yağ asitleri ve monoasilgüritler halinde hidrolize edilir⁶. Bu, Şekil 2’de şematize edilmiştir. Gastrik lipaz, yağ-su arayüzü için midedeki pepsin ve fosfolipitlerle rekabet eder (Şekil 2, gastrik sindirim). Daha sonra, pankreas lipaz / kolipaz, ince bağırsakta tripsin / kimotripsin, fosfolipitler, safra tuzları ve sindirim ürünleri ile rekabet eder. Proteases, lipaz adsorpsiyonunu önleyerek veya destekleyen ara yüz kaplamasını değiştirebilirken, safra tuzları oldukça yüzey aktiftir ve lipaz adsorpsiyonunu teşvik etmek için kalan emülgatörün çoğunun yerini alır (Şekil 2, bağırsak sindirimi). Sonunda, lipolizin hızı ve derecesi, kalınlık, moleküller arası / intramoleküler bağlantılar ve elektrostatik ve sterik etkileşimler gibi ilk / gastrik sindirilmiş emülsiyonun ara yüz özelliklerine bağlıdır. Buna göre, ara yüz tabakasının sindirilirken evrimini izlemek, lipaz adsorpsiyonunu ve dolayısıyla lipit sindirimini etkileyen ara yüz mekanizmalarını ve olaylarını tanımlamak için deneysel bir platform sunar.

Şekil 2: Gastrointestinal lipid sindiriminde arayüzlerin rolünü gösteren şematik diyagram. Pepsin hidrolizi, gastrik fazda ara yüz kompozisyonunu değiştirirken, gastrik lipaz trigliseritleri hidrolize eder. İnce bağırsakta, tripsin / kimotripsin ara yüz filmini daha da hidrolize ederken, lipoliz BS / lipazların adsorpsiyonu, trigliseritlerin hidrolizi ve lipolitik ürünlerin BS miseller / kompleksinde çözünürizasyon yoluyla desorpsiyonu ile ilerler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Granada Üniversitesi’ndeki (UGR) kolye düşürme ekipmanı, toplu çözelti^7’nin alt faz değişimini sağlayan patentli bir teknoloji olan koaksiyel çift kılcal damar ile uygulanmaktadır. Kolye damlasını tutan kılcal damar, bir çift mikroenjektörün her bir kanalına bağımsız olarak bağlanan iki koaksiyel kılcal damarın düzenlenmesinden oluşur. Her mikroenjektör bağımsız olarak çalışabilir ve düşürülen içeriğin akış yoluyla değiştirilmesine izin verir⁷. Buna göre, alt faz değişimi, yeni çözeltinin iç kılcal damar ile eşzamanlı enjeksiyonundan ve aynı akış hızını kullanarak dökme çözeltinin dış kılcal damarla ekstraksiyonundan oluşur. Bu işlem, ara yüzey alanını veya damlacığın hacmini bozmadan dökme çözeltinin değiştirilmesine izin verir. Bu prosedür daha sonra damlacık yığın çözeltisi^8’in sekiz adede kadar sıralı alt faz değişimine izin veren çok alt fazlı bir değiş tokuşa yükseltildi. Bu, sindirim sürecinin, lipidik ortamda asılı kalan tek bir sulu damlacıkta, toplu çözeltiyi farklı bölmeleri (ağız, mide, ince bağırsak) taklit eden yapay ortamlarla sırayla değiştirerek simülasyonunu sağlar. Tüm kurulum, bileşenlerin ayrıntıları da dahil olmak üzere Şekil 3’te temsil edilmektedir. Mikroenjektördeki şırıngalar, her biri Şekil 2’de açıklanan bileşenlerle yapay sindirim sıvısını içeren bir mikrosantrifüj tüpüne bağlanan sekiz vias valfine bağlanır.

Şekil 3: OCTOPUS’un tüm bileşenlerle genel görünümü. CCD kamera, mikroskop, mikro konumlandırıcı, termostabilize hücre ve çift kılcal damar, sekiz vias valfine bağlı iki şırınga ile bir çift mikroenjektöre bağımsız olarak bağlanmıştır. Her şırınga kılcal damar, numune ve bir deşarj ile dört mikrosantrifüj tüpü ile bağlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4A , yapay sindirim sıvılarının her birinin, çift kılcal damar yoluyla subfaz değişimi ile kolye damlasına nasıl enjekte edildiğini göstermektedir. Şekil 2’de detaylandırılan her sindirim bileşiği, gastrointestinal sistemden geçişi simüle ederek eşzamanlı / sıralı olarak uygulanabilir. Yapay sindirim sıvıları, Şekil 4B’de şematize edildiği gibi, ilk emülgatörün ara yüz gerginliğini değiştiren farklı enzimler ve biyosürfaktanlar içerir. Yine UGR’de geliştirilen DINATEN yazılımı (bakınız Malzeme Tablosu), ilk ara yüz tabakası in vitro olarak sindirilirken ara yüz geriliminin evrimini gerçek zamanlı olarak kaydeder. Ayrıca, her sindirim aşamasından sonra, ara yüz tabakasının dilatasyonel elastikiyeti, stabilize edilmiş ara yüz tabakasına hacim / ara yüzey alanının periyodik salınımları uygulanarak ve ara yüz gerginliğinin tepkisi kaydedilerek hesaplanır. Salınımın periyodu/frekansı ve genliği değişebilir ve CONTACTO yazılımı ile görüntü işleme dilatasyonel reolojik parametreleri^{sağlar 8}.

Şekil 4: Sindirim profillerine örnekler . (A) İlk emülgatör tabakası, farklı çözeltilerin kolye damlasına sıralı alt faz değişimi ile mikrosantrifüje yerleştirilen yapay sindirim ortamına maruz bırakılır. (B) İlk emülgatörün ara yüzey geriliminin (y ekseni), yapay ortamdaki çeşitli enzimler / biyosürfaktanlar tarafından in vitro olarak sindirildiği için zamanın bir fonksiyonu (x ekseni) olarak genel evrimi. Düz bağırsak sıvısı ile son bir subfaz değişimi, karışık misellerde çözünür yoluyla sindirilmiş lipitin desorpsiyonunu ölçer. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu çalışma, kolye damlası ekipmanı⁹ ile ara yüz katmanlarının in vitro sindirimini ölçmek için tasarlanmış genel protokolü sunmaktadır. İlk ara yüz tabakası, Şekil 2’de gösterildiği gibi, gastrointestinal sistemden geçişi taklit eden koşullara sırayla maruz kalmaktadır. Bu farklı sindirim ortamları, mikrosantrifüj tüplerinde bulunan farklı çözeltilerin subfaz değişimi ile kolye damlasına enjekte edilir (Şekil 4A). Bu ortamların bileşimi, değerlendirilecek gastrointestinal koşullara, yani gastrik / intestinal proteoliz / lipolize bağlı olarak özelleştirilebilir ve kümülatif etkilerin ve sinerjilerin ölçülmesine izin verir¹⁰. Her bölmedeki sindirim sürecini taklit etmek için kullanılan deneysel koşullar, INFOGEST tarafından yayınlanan ve pH’ı ve elektrolit ve enzim miktarlarını detaylandıran uluslararası konsensüs protokolünü takip eder¹¹. Kolye damlasına dayanan deneysel cihaz, simüle edilmiş sindirim süreci boyunca ara yüz gerginliğinin yerinde kaydedilmesini sağlar. Ara yüz tabakasının dilatasyonel reolojisi, her sindirim adımının sonunda hesaplanır. Bu şekilde, her emülgatör, Şekil 4B’de gösterildiği gibi, sindirilmiş arayüzlerin özelliklerini gösteren bir sindirim profili sunar. Bu, sindirim sürecinin farklı aşamalarına duyarlılığı veya direnci ile ilgili sonuçların çıkarılmasına izin verir. Genel olarak, yapay sindirim ortamı, kendi sindirim sıvılarında (mide veya bağırsak) çözünen asit / bazik pH, elektrolitler, proteazlar (mide ve bağırsak), lipazlar (mide ve bağırsak), safra tuzları ve fosfolipitler içerir. Şekil 4B, bir emülgatörün ara yüz gerginliğinin evriminin genel bir profilini gösterir, ilk önce proteaz etkisine maruz kalır, ardından lipazlar gelir. Genel olarak, ara yüz tabakasının proteolizi, hidrolize peptitlerin desorpsiyonu nedeniyle ara yüz gerginliğinde bir artışı teşvik eder^9,12, lipoliz ise safra tuzlarının ve lipazların adsorpsiyonu nedeniyle ara yüz gerginliğinde çok dik bir azalmaya neden olur ¹³. Bağırsak sıvısı ile son bir subfaz değişimi, adsorbe edilmemiş / sindirilmiş materyalin toplu çözeltisini tüketir ve çözünür bileşiklerin desorpsiyonunu ve sindirilmiş lipitlerin karışık misellerde çözünmesini teşvik eder. Bu, kaydedilen artmış ara yüz gerilimi ile ölçülür (Şekil 4B).

Özetle, in vitro sindirimi tek bir damlacıkta simüle etmek için kolye damlasında uygulanan deneysel tasarım, sindirim işlemi ilk ara yüzey katmanı^10’a sırayla uygulandığı için kümülatif etkilerin ve sinerjilerin ölçülmesine izin verir. Her sindirim ortamının bileşimi, gastrointestinal patolojiler veya bebek sindirim ortamı¹⁴ dahil olmak üzere sindirim koşullarının özelliklerini hesaba katmak için kolayca ayarlanabilir. Daha sonra, proteoliz ve lipolizi etkileyen ara yüz mekanizmalarının tanımlanması, emülsiyonların ara yüz mühendisliği ile sindirimi modüle etmek için kullanılabilir. Elde edilen sonuçlar, düşük alerjenite, kontrollü enerji alımı ve azalmış sindirilebilirlik^{15,16,17,18,19} gibi özel işlevlere sahip yeni gıda matrislerinin tasarımında uygulanabilir.