In vitro Переваривание эмульсий в одной капле с помощью многофазного обмена моделируемых желудочно-кишечных жидкостей

Понимание того, как переваривается жир, что включает в себя эмульсионное пищеварение, важно для рационального проектирования продуктов с индивидуальной функциональностью¹. Субстратом для переваривания жира является эмульсия, так как жир эмульгируется при потреблении путем механического воздействия и смешивания с биоповерхностностями во рту и желудке. Кроме того, большая часть жира, потребляемого людьми, уже эмульгирована (например, молочные продукты), и в случае младенцев или некоторых пожилых людей это единственная форма потребления. Следовательно, дизайн продуктов на основе эмульсии с определенными профилями пищеварения очень важен в питании¹. Кроме того, эмульсии могут инкапсулировать и доставлять питательные вещества, лекарства или липофильные биоактивные^{вещества 2} для лечения различных желудочно-кишечных заболеваний, таких как ожирение³, обогащение питательными веществами, пищевая аллергия и заболевания пищеварительной системы. В эмульсиях масло-вода липидные капли окружены межфазными слоями эмульгаторов, таких как белки, поверхностно-активные вещества, полимеры, частицы и смеси⁴. Роль эмульгаторов двояка: стабилизировать эмульсию⁵ и защитить/транспортировать инкапсулированное соединение к определенному участку. Достижение индивидуальной усвояемости эмульсий зависит от их исходного состава, но также требует мониторинга непрерывной эволюции этого интерфейса во время транзита через желудочно-кишечный тракт (рисунок 1).

Рисунок 1: Применение межфазной инженерии эмульсий для борьбы с некоторыми из основных желудочно-кишечных заболеваний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Переваривание липидов в конечном счете является межфазным процессом, поскольку оно требует адсорбции липаз (желудочных или панкреатических) на границе раздела масло-вода эмульгированных липидных капель через межфазный слой для достижения и гидролиза триглицеридов, содержащихся в масле, в свободные жирные кислоты и моноацилглицериды⁶. Схематизирована на рисунке 2. Желудочная липаза конкурирует с пепсином и фосфолипидами в желудке за границу раздела масло-вода (рисунок 2, желудочное пищеварение). Затем панкреатическая липаза / колипаза конкурируют с трипсином / химотрипсином, фосфолипидами, солями желчи и пищеварительными продуктами в тонком кишечнике. Протеазы могут изменять межфазный охват, предотвращая или способствуя адсорбции липазы, в то время как соли желчи очень активны на поверхности и вытесняют большую часть оставшегося эмульгатора для содействия адсорбции липазы (рисунок 2, кишечное пищеварение). В конце концов, скорость и степень липолиза зависят от межфазных свойств исходной/желудочной перевариваемой эмульсии, таких как толщина, межмолекулярные связи и электростатические и стерические взаимодействия. Соответственно, мониторинг эволюции межфазного слоя по мере его переваривания предлагает экспериментальную платформу для выявления межфазных механизмов и событий, влияющих на адсорбцию липазы и, следовательно, на переваривание липидов.

Рисунок 2: Принципиальная диаграмма, иллюстрирующая роль интерфейсов в желудочно-кишечном липидном переваривании. Гидролиз пепсина изменяет межфазный состав в желудочной фазе, в то время как желудочная липаза гидролизует триглицериды. В тонком кишечнике трипсин/химотрипсин дополнительно гидролизуют межфазную пленку, в то время как липолиз протекает путем адсорбции BS/липаз, гидролиза триглицеридов и десорбции липолитических продуктов путем солюбилизации в мицеллах/комплексе BS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Подвесное капельное оборудование в Университете Гранады (UGR) реализовано с запатентованной технологией, коаксиальным двойным капилляром, что позволяет осуществлять субфазный обмен объемного раствора⁷. Капилляр, удерживающий подвесную каплю, состоит из расположения двух коаксиальных капилляров, которые независимо соединены с каждым каналом двойного микроинжектора. Каждый микроинжектор может работать независимо, что позволяет обмениваться сброшенным содержимым сквозным потоком⁷. Соответственно, субфазный обмен состоит из одновременного введения нового раствора с внутренним капилляром и экстракции объемного раствора с наружным капилляром с использованием той же скорости потока. Этот процесс позволяет заменить объемный раствор без нарушения межфазной области или объема капли. Позже эта процедура была модернизирована до многофазного обмена, который позволяет проводить до восьми последовательных подфазных обменов капельного объемного раствора⁸. Это позволяет моделировать пищеварительный процесс в одной водной капле, взвешенной в липидных средах, путем последовательного обмена объемным раствором с искусственными средами, имитирующими различные отсеки (рот, желудок, тонкая кишка). Вся установка представлена на рисунке 3, включая детали компонентов. Шприцы в микроинжекторе соединены с восемью клапанами, каждый из которых подключается к микроцентрифужной трубке, содержащей искусственную пищеварительную жидкость с компонентами, описанными на фиг.2.

Рисунок 3: Общий вид OCTOPUS со всеми компонентами. ПЗС-камера, микроскоп, микропозитор, термостабилизированная ячейка и двойной капилляр соединены независимо друг от друга с двойным микроинжектором с двумя шприцевыми шприцевыми, соединенными с восемью клапанами. Каждый шприц соединяется с капиллярами, четырьмя микроцентрифужными трубками с образцом и одним разрядом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

На рисунке 4А показано, как каждая из искусственных пищеварительных жидкостей вводится в подвесную каплю путем субфазного обмена через двойной капилляр. Каждое пищеварительное соединение, описанное на фиг.2 , может применяться одновременно/последовательно, имитируя прохождение через желудочно-кишечный тракт. Искусственные пищеварительные жидкости содержат различные ферменты и биозащищенные вещества, которые изменяют межфазное напряжение исходного эмульгатора, как схематизировано на рисунке 4B. Программное обеспечение DINATEN (см. Таблицу материалов), также разработанное в UGR, регистрирует эволюцию межфазного напряжения в режиме реального времени, когда начальный межфазный слой переваривается in vitro. Кроме того, после каждой пищеварительной фазы дилатационная эластичность межфазного слоя вычисляется путем наложения периодических колебаний объема/межфазной области на стабилизированный межфазный слой и регистрации реакции межфазного напряжения. Период/частота и амплитуда колебаний могут варьироваться, а обработка изображений с помощью программного обеспечения CONTACTO обеспечивает дилатационные реологические параметры⁸.

Рисунок 4: Примеры профилей пищеварения. (А) Исходный слой эмульгатора подвергают искусственной пищеварительной среде, помещенной в микроцентрифугу путем последовательного субфазного обмена различных растворов в подвесную каплю. (B) Общая эволюция межфазного напряжения (ось Y) исходного эмульгатора в зависимости от времени (ось x), когда он переваривается in vitro различными ферментами/биоповерхноводчиками в искусственных средах. Заключительный субфазный обмен с простой кишечной жидкостью измеряет десорбцию переваренного липида путем солюбилизации в смешанных мицеллах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

В данном исследовании представлен общий протокол, предназначенный для измерения in vitro переваривания межфазных слоев с помощью подвесного капельного оборудования⁹. Начальный межфазный слой подвергается последовательно условиям, имитирующим прохождение через желудочно-кишечный тракт, как показано на рисунке 2. Эти различные пищеварительные среды вводят в подвесную каплю путем субфазного обмена различных растворов, содержащихся в микроцентрифужных трубках (рисунок 4А). Состав этих сред может быть настроен в зависимости от желудочно-кишечных состояний, которые будут оцениваться, а именно желудочного / кишечного протеолиза / липолиза, что позволяет измерять кумулятивные эффекты и синергии¹⁰. Экспериментальные условия, используемые для имитации процесса пищеварения в каждом отсеке, соответствуют международному консенсусному протоколу, опубликованному INFOGEST, в котором подробно описывается рН и количество электролитов и ферментов¹¹. Экспериментальное устройство на основе подвесного капли позволяет регистрировать межфазное натяжение in situ на протяжении всего моделируемого процесса пищеварения. Дилатационная реология межфазного слоя вычисляется в конце каждой пищеварительной стадии. Таким образом, каждый эмульгатор предлагает профиль пищеварения, иллюстрирующий свойства переваренных интерфейсов, как показано на рисунке 4B. Это позволяет извлекать выводы относительно его восприимчивости или устойчивости к различным стадиям пищеварительного процесса. В целом, искусственные пищеварительные среды содержат кислоту / основной рН, электролиты, протеазы (желудочные и кишечные), липазы (желудочные и кишечные), желчные соли и фосфолипиды, которые растворяются в соответствующих пищеварительных жидкостях (желудочных или кишечных). На рисунке 4B показан общий профиль эволюции межфазного напряжения эмульгатора, сначала подвергающегося протеазному действию, а затем липазы. В целом, протеолиз межфазного слоя способствует увеличению межфазного напряжения вследствие десорбции гидролизованных пептидов ^9,12, в то время как липолиз приводит к очень резкому снижению межфазного напряжения за счет адсорбции желчных солей и липаз¹³. Заключительный субфазный обмен с кишечной жидкостью истощает объемный раствор нерассеянного/переваренного материала и способствует десорбции растворимых соединений и солюбилизации переваренных липидов в смешанных мицеллах. Это количественно определяется зарегистрированным увеличением межфазного напряжения (рисунок 4В).

Таким образом, экспериментальная конструкция, реализованная в подвесной капле для имитации переваривания in vitro в одной капле, позволяет измерять кумулятивные эффекты и синергизм, поскольку процесс пищеварения последовательно применяется к начальному межфазному слою¹⁰. Состав каждой пищеварительной среды может быть легко настроен с учетом особенностей пищеварительных состояний, включая желудочно-кишечные патологии или пищеварительные среды¹⁴ у младенцев. Затем идентификация межфазных механизмов, влияющих на протеолиз и липолиз, может быть использована для модуляции пищеварения путем межфазной инженерии эмульсий. Полученные результаты могут быть применены при разработке новых пищевых матриц с индивидуальными функциональными возможностями, такими как низкая аллергенность, контролируемое потребление энергии и снижение усвояемости 15,16,17,18,19.