Özet

In vitro Digestión de emulsiones en una sola gota a través del intercambio multifásico de fluidos gastrointestinales simulados

Published: November 18, 2022
doi:

Özet

Un balance colgante de película de superficie de gota implementado con un intercambio multisubfase, apodado OCTOPUS, permite imitar las condiciones digestivas mediante el intercambio secuencial de subfases de la solución a granel original con fluidos gastrointestinales simulados. La digestión in vitro simulada se monitoriza registrando in situ la tensión interfacial de la capa interfacial digerida.

Abstract

Las emulsiones se utilizan actualmente para encapsular y administrar nutrientes y medicamentos para abordar diferentes afecciones gastrointestinales como la obesidad, la fortificación de nutrientes, las alergias alimentarias y las enfermedades digestivas. La capacidad de una emulsión para proporcionar la funcionalidad deseada, es decir, alcanzar un sitio específico dentro del tracto gastrointestinal, inhibir / retrasar la lipólisis o facilitar la digestibilidad, depende en última instancia de su susceptibilidad a la degradación enzimática en el tracto gastrointestinal. En las emulsiones de aceite en agua, las gotas de lípidos están rodeadas por capas interfaciales, donde los emulsionantes estabilizan la emulsión y protegen el compuesto encapsulado. Lograr una digestibilidad adaptada de las emulsiones depende de su composición inicial, pero también requiere monitorear la evolución de esas capas interfaciales a medida que se someten a diferentes fases de la digestión gastrointestinal. Una balanza de película de superficie de gota colgante implementada con un intercambio multisubfase permite simular la digestión in vitro de emulsiones en una sola gota acuosa sumergida en aceite mediante la aplicación de un modelo de digestión estática personalizado. El tránsito a través del tracto gastrointestinal es imitado por el intercambio de subfases de la solución a granel de gotitas original con medios artificiales, imitando las condiciones fisiológicas de cada compartimento / paso del tracto gastrointestinal. La evolución dinámica de la tensión interfacial se registra in situ a lo largo de toda la digestión gastrointestinal simulada. Las propiedades mecánicas de las interfaces digeridas, como la elasticidad dilatacional interfacial y la viscosidad, se miden después de cada fase de digestión (oral, gástrico, intestino delgado). La composición de cada medio digestivo se puede ajustar para tener en cuenta las particularidades de las afecciones digestivas, incluidas las patologías gastrointestinales y los medios digestivos infantiles. Se identifican los mecanismos interfaciales específicos que afectan la proteólisis y la lipólisis, proporcionando herramientas para modular la digestión mediante la ingeniería interfacial de emulsiones. Los resultados obtenidos pueden manipularse para diseñar matrices de nuevos alimentos con funcionalidades personalizadas como baja alergenicidad, ingesta de energía controlada y disminución de la digestibilidad.

Introduction

Comprender cómo se digiere la grasa, lo que implica la digestión en emulsión, es importante para diseñar racionalmente productos con funcionalidad personalizada1. El sustrato para la digestión de grasas es una emulsión ya que la grasa se emulsiona al consumirla por acción mecánica y mezclándola con biosurfactantes en la boca y el estómago. Además, la mayor parte de la grasa consumida por los humanos ya está emulsionada (como los productos lácteos), y en el caso de los bebés o algunas personas mayores, esta es la única forma de consumo. Por lo tanto, el diseño de productos a base de emulsión con perfiles de digestión específicos es muy importante en nutrición1. Además, las emulsiones pueden encapsular y administrar nutrientes, medicamentos o bioactivos lipofílicos2 para abordar diferentes afecciones gastrointestinales como la obesidad3, la fortificación de nutrientes, las alergias alimentarias y las enfermedades digestivas. En las emulsiones de aceite en agua, las gotas de lípidos están rodeadas por capas interfaciales de emulsionantes como proteínas, surfactantes, polímeros, partículas y mezclas4. El papel de los emulsionantes es doble: estabilizar la emulsión5 y proteger/transportar el compuesto encapsulado a un sitio específico. Lograr una digestibilidad adaptada de las emulsiones depende de su composición inicial, pero también requiere monitorear la evolución continua de esta interfaz durante el tránsito a través del tracto gastrointestinal (Figura 1).

Figure 1
Figura 1: Aplicación de la ingeniería interfacial de emulsiones para abordar algunas de las principales afecciones gastrointestinales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La digestión de lípidos es, en última instancia, un proceso interfacial porque requiere la adsorción de lipasas (gástricas o pancreáticas) en la interfaz aceite-agua de gotitas de lípidos emulsionadas a través de la capa interfacial para alcanzar e hidrolizar los triglicéridos contenidos en el aceite en ácidos grasos libres y monoacilglicéridos6. Esto se esquematiza en la Figura 2. La lipasa gástrica compite con la pepsina y los fosfolípidos en el estómago por la interfaz aceite-agua (Figura 2, digestión gástrica). Luego, la lipasa/colipasa pancreática compite con tripsina/quimotripsina, fosfolípidos, sales biliares y productos digestivos en el intestino delgado. Las proteasas pueden alterar la cobertura interfacial, impidiendo o favoreciendo la adsorción de lipasa, mientras que las sales biliares son altamente activas en superficie y desplazan la mayor parte del emulsionante restante para promover la adsorción de lipasa (Figura 2, digestión intestinal). Eventualmente, la velocidad y el alcance de la lipólisis dependen de las propiedades interfaciales de la emulsión inicial / gástrica digerida, como el grosor, las conexiones intermoleculares / intramoleculares y las interacciones electrostáticas y estéricas. En consecuencia, el monitoreo de la evolución de la capa interfacial a medida que se digiere ofrece una plataforma experimental para identificar los mecanismos interfaciales y los eventos que afectan la adsorción de la lipasa y, por lo tanto, la digestión de los lípidos.

Figure 2
Figura 2: Diagrama esquemático que ilustra el papel de las interfaces en la digestión de lípidos gastrointestinales. La hidrólisis de pepsina altera la composición interfacial en la fase gástrica, mientras que la lipasa gástrica hidroliza los triglicéridos. En el intestino delgado, la tripsina/quimotripsina hidroliza aún más la película interfacial, mientras que la lipólisis procede por la adsorción de BS/lipasas, la hidrólisis de triglicéridos y la desorción de productos lipolíticos por solubilización en las micelas/complejo BS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El equipo de caída colgante de la Universidad de Granada (UGR) se implementa con una tecnología patentada, el doble capilar coaxial, que permite el intercambio subfásico de la solución a granel7. El capilar, que sostiene la gota colgante, consiste en una disposición de dos capilares coaxiales que están conectados independientemente a cada canal de un microinyector doble. Cada microinyector puede funcionar de forma independiente, lo que permite el intercambio del contenido caído por flujopasante 7. En consecuencia, el intercambio de subfases consiste en la inyección simultánea de la nueva solución con el capilar interno y la extracción de la solución a granel con el capilar externo utilizando el mismo caudal. Este proceso permite el reemplazo de la solución a granel sin perturbar el área interfacial o el volumen de la gota. Este procedimiento se actualizó posteriormente a un intercambio multifásico, que permite hasta ocho intercambios secuenciales de subfase de la solución masiva de gotas8. Esto permite la simulación del proceso digestivo en una sola gota acuosa suspendida en medios lipídicos mediante el intercambio secuencial de la solución a granel con medios artificiales que imitan los diferentes compartimentos (boca, estómago, intestino delgado). Toda la configuración se representa en la Figura 3, incluidos los detalles de los componentes. Las jeringas en el microinyector están conectadas a las ocho válvulas vías, cada una conectada a un tubo de microcentrífuga que contiene el líquido digestivo artificial con los componentes descritos en la Figura 2.

Figure 3
Figura 3: Vista general del OCTOPUS con todos los componentes. La cámara CCD, el microscopio, el microposicionador, la célula termoestabilizada y el doble capilar se conectaron independientemente a un microinyector doble con dos jeringas conectadas a ocho válvulas vías. Cada jeringa se conecta con capilar, cuatro tubos de microcentrífuga con muestra y una descarga. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 4A muestra cómo cada uno de los fluidos digestivos artificiales se inyecta en la gota colgante por intercambio de subfases a través del doble capilar. Cada compuesto digestivo detallado en la Figura 2 se puede aplicar simultáneamente/secuencialmente, simulando el paso a través del tracto gastrointestinal. Los fluidos digestivos artificiales contienen diferentes enzimas y biosurfactantes, que alteran la tensión interfacial del emulsionante inicial, como se esquematiza en la Figura 4B. El software DINATEN (ver Tabla de materiales), también desarrollado en la UGR, registra la evolución de la tensión interfacial en tiempo real a medida que se digiere in vitro la capa interfacial inicial. Además, después de cada fase digestiva, la elasticidad dilatacional de la capa interfacial se calcula imponiendo oscilaciones periódicas de volumen / área interfacial sobre la capa interfacial estabilizada y registrando la respuesta de la tensión interfacial. El período/frecuencia y la amplitud de la oscilación pueden variarse, y el procesamiento de imágenes con el software CONTACTO proporciona los parámetros reológicos dilatacionales8.

Figure 4
Figura 4: Ejemplos de perfiles de digestión . (A) La capa emulsionante inicial se somete a medios digestivos artificiales colocados en la microcentrífuga mediante el intercambio secuencial de subfase de las diferentes soluciones en la gota colgante. (B) La evolución general de la tensión interfacial (eje y) del emulsionante inicial en función del tiempo (eje x) a medida que es digerido in vitro por las diversas enzimas/biosurfactantes en los medios artificiales. Un intercambio final de subfases con líquido intestinal simple mide la desorción de lípidos digeridos por solubilización en micelas mixtas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este estudio presenta el protocolo general diseñado para medir la digestión in vitro de capas interfaciales con equipo de gota colgante9. La capa interfacial inicial se somete secuencialmente a condiciones que imitan el paso a través del tracto gastrointestinal, como se muestra en la Figura 2. Estos diferentes medios digestivos se inyectan en la gota colgante mediante el intercambio de subfases de las diferentes soluciones contenidas en los tubos de microcentrífuga (Figura 4A). La composición de estos medios puede ser personalizada dependiendo de las condiciones gastrointestinales que serán evaluadas, a saber, proteólisis/lipólisis gástrica/intestinal, permitiendo medir efectos acumulativos y sinergias10. Las condiciones experimentales utilizadas para imitar el proceso de digestión en cada compartimento siguen el protocolo de consenso internacional publicado por INFOGEST que detalla el pH y las cantidades de electrolitos y enzimas11. El dispositivo experimental basado en gota colgante permite registrar la tensión interfacial in situ durante todo el proceso de digestión simulado. La reología dilatacional de la capa interfacial se calcula al final de cada paso digestivo. De esta manera, cada emulsionante ofrece un perfil de digestión que ilustra las propiedades de las interfaces digeridas, como se muestra en la Figura 4B. Esto permite extraer conclusiones sobre su susceptibilidad o resistencia a las diferentes etapas del proceso digestivo. En general, los medios digestivos artificiales contienen pH ácido/básico, electrolitos, proteasas (gástricas e intestinales), lipasas (gástricas e intestinales), sales biliares y fosfolípidos, que se disuelven en sus respectivos fluidos digestivos (gástricos o intestinales). La figura 4B muestra un perfil genérico de la evolución de la tensión interfacial de un emulsionante, primero sometida a la acción de la proteasa, seguida de las lipasas. En general, la proteólisis de la capa interfacial promueve un aumento de la tensión interfacial debido a la desorción de péptidos hidrolizados9,12, mientras que la lipólisis resulta en una reducción muy pronunciada de la tensión interfacial debido a la adsorción de sales biliares y lipasas 13. Un intercambio final de subfases con líquido intestinal agota la solución a granel de material no adsorbido / digerido y promueve la desorción de compuestos solubles y la solubilización de lípidos digeridos en micelas mixtas. Esto se cuantifica por el aumento de la tensión interfacial registrado (Figura 4B).

En resumen, el diseño experimental implementado en la gota colgante para simular la digestión in vitro en una sola gota permite medir los efectos acumulativos y las sinergias a medida que el proceso de digestión se aplica secuencialmente a la capa interfacial inicial10. La composición de cada medio digestivo puede ajustarse fácilmente para tener en cuenta las particularidades de las condiciones digestivas, incluidas las patologías gastrointestinales o los medios digestivos infantiles14. Luego, la identificación de los mecanismos interfaciales que afectan la proteólisis y la lipólisis se puede utilizar para modular la digestión mediante la ingeniería interfacial de emulsiones. Los resultados obtenidos se pueden aplicar en el diseño de matrices de nuevos alimentos con funcionalidades personalizadas como baja alergenicidad, ingesta de energía controlada y disminución de la digestibilidad 15,16,17,18,19.

Protocol

1. Secuencia de limpieza para toda la cristalería utilizada en la experimentación científica de superficies Frote la cristalería con una solución de limpieza concentrada (consulte la Tabla de materiales) diluida en agua (10%). Enjuague bien con una secuencia de agua del grifo, propanol, agua destilada y agua ultrapura. Secar en una cabina y almacenar en un gabinete cerrado hasta su uso. 2. Preparación de la muestra</strong…

Representative Results

Esta sección muestra diferentes ejemplos de perfiles de digestión medidos con el pulpo. La apariencia general de las coincidencias del perfil de digestión simulado se muestra en la Figura 4B. La tensión interfacial generalmente se representa contra el tiempo en el perfil de digestión. Las diferentes fases / pasos de digestión considerados están representados en diferentes colores. La primera fase forma la capa inicial y corresponde a la fase de adsorción del emulsionante o proteína/…

Discussion

Este artículo describe un protocolo generalizado para medir la digestión in vitro de capas interfaciales mediante el uso de equipos de gota colgante. El protocolo se puede ajustar a los requisitos específicos del experimento ajustando la composición de los tampones digestivos, que se basan en el protocolo armonizado INFOGEST11,20 para facilitar la comparación con la literatura. Las enzimas digestivas y los biosurfactantes se pueden agregar individua…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta investigación ha sido financiada por los proyectos RTI2018-101309-B-C21 y PID2020-631-116615RAI00, financiados por MCIN/AEI/10.13039/501100011033 y por “FEDER Una forma de hacer Europa”. Este trabajo fue (parcialmente) apoyado por el Grupo de Biocoloide y Física de Fluidos (ref. PAI-FQM115) de la Universidad de Granada (España).

Materials

Alpha-chymotrypsin from bovine pancreas Sigma-Aldrich C4129 Enzyme
Beta-lactoglobulin Sigma-Aldrich L0130 Emulsfier
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich 9048-46-8 Emulsfier
CaCl2 Sigma-Aldrich 10043-52-4 Electrolyte
Centrifuge Kronton instruments Centrikon T-124 For separating oil and resins
Citrus pectin Sigma-Aldrich P9135 Emulsfier
co-lipase FROM PORCINE PANCREAS Sigma C3028 Enzyme
CONTACTO University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
DINATEN University of Granada (UGR) https://core.ugr.es/dinaten/, last access: 07/18/2022
Gastric lipase Lipolytech RGE15-1G Enzyme
Human Serum Albumin Sigma-Aldrich 70024-90-7 Emulsifier
INFOGEST http://www.proteomics.ch/IVD/
Lipase from porcine pancreas, type II Sigma-Aldrich L33126 Enzyme
Magnesium metasilicate resins Fluka 1343-88-0 Resins to purify oil
Micro 90 International products M-9051-04 Cleaner
NaCl Sigma 7647-14-5 Electrolyte
NaH2PO4 Scharlau 10049-21-5 To prepare buffer
OCTOPUS Producciones Científicas y Técnicas S.L. (Gójar, Spain) Pendandt Drop Equipment implemented with multi subphase exchange
Olive oil Sigma-Aldrich 1514 oil
Pancreatic from porcine pancreas Sigma P7545-25 g Enzyme
Pepsin Sigma-Aldrich P6887 Enzyme
Pluronic F127 Sigma P2443 Emulsifier
Pluronic F68 Sigma P1300 Emulsfier
Sodium deoxycholate Sigma Bile salts
Sodium glycodeoxycholate Sigma C9910 Bile salts
Sodium taurocholate Sigma 86339 Bile salts
Syringe Filter Millex-DP SLGP033R  Syringe Filter 0.22 µm pore size polyethersulfone
Trypsin Sigma-Aldrich T1426 Enzyme

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Maldonado-Valderrama, J., del Castillo Santaella, T., Holgado-Terriza, J. A., Cabrerizo-Vílchez, M. Á. In vitro Digestion of Emulsions in a Single Droplet via Multi Subphase Exchange of Simulated Gastrointestinal Fluids. J. Vis. Exp. (189), e64158, doi:10.3791/64158 (2022).

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