In vitro Vertering van emulsies in een enkele druppel via multi-subfase-uitwisseling van gesimuleerde gastro-intestinale vloeistoffen

Begrijpen hoe vet wordt verteerd, waarbij emulsievergisting betrokken is, is belangrijk om producten rationeel te ontwerpen met op maat gemaakte functionaliteit¹. Het substraat voor vetvertering is een emulsie omdat vet wordt geëmulgeerd bij consumptie door mechanische actie en vermenging met biosurfactanten in de mond en maag. Ook is het grootste deel van het vet dat door mensen wordt geconsumeerd al geëmulgeerd (zoals melkproducten) en in het geval van baby’s of sommige ouderen is dit de enige vorm van consumptie. Daarom is het ontwerp van op emulsie gebaseerde producten met specifieke spijsverteringsprofielen erg belangrijk in voeding¹. Bovendien kunnen emulsies voedingsstoffen, medicijnen of lipofiele bioactieve stoffen inkapselen en leveren² om verschillende gastro-intestinale aandoeningen aan te pakken, zoals obesitas³, verrijking van voedingsstoffen, voedselallergieën en spijsverteringsziekten. In olie-in-water emulsies worden lipidedruppels omgeven door interfaciale lagen van emulgatoren zoals eiwitten, oppervlakteactieve stoffen, polymeren, deeltjes en mengsels⁴. De rol van emulgatoren is tweeledig: stabiliseer de emulsie⁵ en bescherm/transporteer de ingekapselde verbinding naar een specifieke locatie. Het bereiken van een op maat gemaakte verteerbaarheid van emulsies hangt af van hun oorspronkelijke samenstelling, maar vereist ook het monitoren van de continue evolutie van deze interface tijdens de transit door het maagdarmkanaal (figuur 1).

Figuur 1: Interfaciale engineering van emulsies toepassen om enkele van de belangrijkste gastro-intestinale aandoeningen aan te pakken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Lipidenvertering is uiteindelijk een interfacial proces omdat het de adsorptie van lipasen (maag of pancreas) op het olie-water-grensvlak van geëmulgeerde lipidedruppels door de interfaciale laag vereist om de triglyceriden in de olie te bereiken en te hydrolyseren tot vrije vetzuren en monoacylglyceriden⁶. Dit is geschematiseerd in figuur 2. Maaglipase concurreert met pepsine en fosfolipiden in de maag voor de olie-water interface (Figuur 2, maagvertering). Vervolgens concurreren pancreaslipase / colipase met trypsine / chymotrypsine, fosfolipiden, galzouten en spijsverteringsproducten in de dunne darm. Proteasen kunnen de interfaciale dekking veranderen, waardoor lipase-adsorptie wordt voorkomen of begunstigd, terwijl galzouten zeer oppervlakteactief zijn en het grootste deel van de resterende emulgator verdringen om lipase-adsorptie te bevorderen (figuur 2, intestinale spijsvertering). Uiteindelijk zijn de snelheid en de omvang van lipolyse afhankelijk van de interfaciale eigenschappen van de initiële / maagverteerde emulsie, zoals de dikte, inter / intramoleculaire verbindingen en elektrostatische en sterische interacties. Dienovereenkomstig biedt het monitoren van de evolutie van de interfaciale laag terwijl deze wordt verteerd een experimenteel platform om interfaciale mechanismen en gebeurtenissen te identificeren die van invloed zijn op lipase-adsorptie en dus lipidenvertering.

Figuur 2: Schematisch diagram dat de rol van interfaces in gastro-intestinale lipidenvertering illustreert. Pepsinehydrolyse verandert de interfaciale samenstelling in de maagfase, terwijl maaglipase triglyceriden hydrolyseert. In de dunne darm hydrolyseren trypsine / chymotrypsine de interfaciale film verder, terwijl lipolyse verloopt door de adsorptie van BS / lipasen, de hydrolyse van triglyceriden en de desorptie van lipolytische producten door oplosbaarheid in de BS-micellen / complex. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De hanger drop apparatuur aan de Universiteit van Granada (UGR) is geïmplementeerd met een gepatenteerde technologie, de coaxiale dubbele capillaire, die subfase uitwisseling van de bulkoplossing mogelijk maakt⁷. Het capillair, dat de hangerdruppel vasthoudt, bestaat uit een opstelling van twee coaxiale haarvaten die onafhankelijk verbonden zijn met elk kanaal van een dubbele micro-injector. Elke microinjector kan onafhankelijk werken, waardoor de gedropte inhoud kan worden uitgewisseld door through-flow⁷. Dienovereenkomstig bestaat de subfase-uitwisseling uit de gelijktijdige injectie van de nieuwe oplossing met het binnenste capillair en de extractie van de bulkoplossing met het buitenste capillair met hetzelfde debiet. Dit proces maakt de vervanging van de bulkoplossing mogelijk zonder verstoring van het interfaciale gebied of het volume van de druppel. Deze procedure werd later opgewaardeerd tot een multi-subfase-uitwisseling, die maximaal acht opeenvolgende subfase-uitwisselingen van de druppelbulkoplossing⁸ mogelijk maakt. Dit maakt de simulatie van het spijsverteringsproces mogelijk in een enkele waterige druppel gesuspendeerd in lipidische media door de bulkoplossing sequentieel uit te wisselen met kunstmatige media die de verschillende compartimenten (mond, maag, dunne darm) nabootsen. De hele opstelling is weergegeven in figuur 3, inclusief de details van de componenten. De spuiten in de microinjector zijn verbonden met de acht vias-kleppen, die elk worden aangesloten op een microcentrifugebuis met de kunstmatige spijsverteringsvloeistof met componenten die zijn beschreven in figuur 2.

Figuur 3: Algemeen beeld van de OCTOPUS met alle componenten. De CCD-camera, microscoop, micropositioner, thermogestabiliseerde cel en dubbel capillair onafhankelijk verbonden met een dubbele micro-injector met twee spuiten verbonden met acht vias-kleppen. Elke spuit wordt aangesloten op capillair, vier microcentrifugebuizen met monster en één ontlading. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4A laat zien hoe elk van de kunstmatige spijsverteringsvloeistoffen druppelsgewijs in de hanger wordt geïnjecteerd door subfase-uitwisseling via het dubbele capillair. Elke spijsverteringsverbinding zoals beschreven in figuur 2 kan gelijktijdig/sequentieel worden aangebracht, waarbij de passage door het maagdarmkanaal wordt gesimuleerd. De kunstmatige spijsverteringsvloeistoffen bevatten verschillende enzymen en biosurfactanten, die de interfaciale spanning van de initiële emulgator veranderen, zoals geschematiseerd in figuur 4B. De software DINATEN (zie Materiaaltabel), ook ontwikkeld aan de UGR, registreert de evolutie van de interfaciale spanning in real time terwijl de initiële interfaciale laag in vitro wordt verteerd. Ook wordt na elke spijsverteringsfase de dilatatie-elasticiteit van de interfaciale laag berekend door periodieke oscillaties van volume / interfacial gebied op de gestabiliseerde interfaciale laag op te leggen en de respons van de interfaciale spanning te registreren. De periode/frequentie en de amplitude van de oscillatie kunnen worden gevarieerd en beeldverwerking met de software CONTACTO levert de dilatatiereologische parameters⁸.

Figuur 4: Voorbeelden van verteringsprofielen. (A) De initiële emulgatorlaag wordt onderworpen aan kunstmatige spijsverteringsmedia die in de microcentrifuge worden geplaatst door sequentiële subfase-uitwisseling van de verschillende oplossingen in de hangende druppel. (B) De algemene evolutie van de interfaciale spanning (y-as) van de initiële emulgator als functie van de tijd (x-as) zoals deze in vitro wordt verteerd door de verschillende enzymen/biosurfactanten in de kunstmatige media. Een laatste subfase-uitwisseling met gewoon darmvocht meet de desorptie van verteerd lipide door oplosbaarheid in gemengde micellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Deze studie presenteert het algemene protocol dat is ontworpen om de in vitro vertering van interfaciale lagen te meten met hangervalapparatuur⁹. De initiële interfaciale laag wordt achtereenvolgens onderworpen aan aandoeningen die de passage door het maagdarmkanaal nabootsen, zoals weergegeven in figuur 2. Deze verschillende spijsverteringsmedia worden in de hangende druppel geïnjecteerd door subfase-uitwisseling van de verschillende oplossingen in de microcentrifugebuizen (figuur 4A). De samenstelling van deze media kan worden aangepast afhankelijk van de gastro-intestinale aandoeningen die zullen worden geëvalueerd, namelijk maag / intestinale proteolyse / lipolyse, waardoor cumulatieve effecten en zondaars^{kunnen worden gemeten 10}. De experimentele omstandigheden die worden gebruikt om het verteringsproces in elk compartiment na te bootsen, volgen het internationale consensusprotocol dat door INFOGEST is gepubliceerd en waarin de pH en hoeveelheden elektrolyten en enzymen^{worden beschreven 11}. Het experimentele apparaat op basis van hangerval maakt het mogelijk om de interfaciale spanning in situ te registreren tijdens het gesimuleerde verteringsproces. De dilatationale reologie van de interfaciale laag wordt berekend aan het einde van elke spijsverteringsstap. Op deze manier biedt elke emulgator een verteringsprofiel dat de eigenschappen van de verteerde interfaces illustreert, zoals weergegeven in figuur 4B. Dit maakt het mogelijk om conclusies te trekken met betrekking tot de gevoeligheid of weerstand tegen de verschillende stadia van het spijsverteringsproces. Over het algemeen bevatten de kunstmatige spijsverteringsmedia zure / basische pH, elektrolyten, proteasen (maag en darm), lipasen (maag en darm), galzouten en fosfolipiden, die zijn opgelost in hun respectieve spijsverteringsvloeistoffen (maag of darm). Figuur 4B toont een generiek profiel van de evolutie van de interfaciale spanning van een emulgator, eerst onderworpen aan protease-actie, gevolgd door lipasen. Over het algemeen bevordert proteolyse van de interfaciale laag een toename van de interfaciale spanning als gevolg van de desorptie van gehydrolyseerde peptiden ^9,12, terwijl lipolyse resulteert in een zeer steile vermindering van de interfaciale spanning als gevolg van de adsorptie van galzouten en lipasen¹³. Een laatste subfase-uitwisseling met darmvocht put de bulkoplossing van niet-geabsorbeerd / verteerd materiaal uit en bevordert de desorptie van oplosbare verbindingen en de oplosbaarheid van verteerde lipiden in gemengde micellen. Dit wordt gekwantificeerd door de toegenomen interfaciale spanning die is geregistreerd (figuur 4B).

Samenvattend, het experimentele ontwerp geïmplementeerd in de hangerdruppel om in vitro vertering in een enkele druppel te simuleren, maakt het mogelijk om cumulatieve effecten en synergieën te meten terwijl het spijsverteringsproces sequentieel wordt toegepast op de initiële interfaciale laag¹⁰. De samenstelling van elk spijsverteringsmedium kan eenvoudig worden afgestemd om rekening te houden met de bijzonderheden van de spijsverteringsaandoeningen, waaronder gastro-intestinale pathologieën of spijsverteringsmedia voor zuigelingen¹⁴. Vervolgens kan de identificatie van de interfaciale mechanismen die proteolyse en lipolyse beïnvloeden, worden gebruikt om de spijsvertering te moduleren door de interfaciale engineering van emulsies. De verkregen resultaten kunnen worden toegepast bij het ontwerpen van nieuwe voedselmatrices met op maat gemaakte functionaliteiten zoals lage allergeniciteit, gecontroleerde energie-inname en verminderde verteerbaarheid 15,16,17,18,19.