バース症候群の迅速な診断のための質量分析による白血球中のカルディオリピンのフィンガープリント
Özet
このプロトコルは、バース症候群の診断のために白血球カルジオリピンの質量分析学的「指紋」を得る方法を示す。増加したモノリソカルジオリピン対カルジオリピン比の評価は、100%の感度および特異性を有する対照心不全患者からバース症候群の患者を区別する。
Abstract
カルディオリピン(CL)は、その構造中に4つの脂肪酸鎖を有する二量体リン脂質であり、ミトコンドリアの脂質マーカーであり、内膜の機能に重要な役割を果たしている。その代謝産物モノリゾカルジオリピン(MLCL)は、動物細胞の脂質抽出物中に生理学的にほとんど存在せず、その外観は、乳児期に重度の心筋症を引き起こすまれでしばしば誤診される遺伝性疾患であるバース症候群(BTHS)の特徴である。ここで記載される方法は、「カルジオリピン指紋」を生成し、細胞脂質プロファイルにおけるCLおよびMLCL種の相対レベルの簡単なアッセイを可能にする。白血球の場合、マトリックス支援レーザー脱離イオン化 – 飛行時間/質量分析(MALDI-TOF/MS) を介して MLCL/CL比を測定するために必要な血液はわずか1mLです。このアッセイは簡単で、臨床生化学研究所のルーチンワークに簡単に統合してBTHSをスクリーニングできます。この試験は、BTHSに対して100%の感度と特異度を示し、適切な診断試験となっています。
Introduction
バース症候群(BTHS)は、早期発症心筋症、骨格筋ミオパチー、成長遅延、好中球減少症、可変ミトコンドリア呼吸鎖機能障害、および異常なミトコンドリア構造1、2、3、4、5を特徴とするまれなX連鎖疾患である。BTHSの罹患率は100万人の男性につき1例で、現在世界中で知られている症例は250例未満ですが、この疾患が過小診断されていることは広く受け入れられています2,6。BTHSは、染色体Xq28.12 7,8に局在するタファジン(TAFAZZIN)遺伝子の機能喪失変異から生じ、ミトコンドリアリン脂質カルジオリピン(CL)の欠損リモデリングを引き起こし、通常は高度に対称で不飽和なアシル組成物9,10をもたらすプロセスである。CLはミトコンドリアのシグネチャー脂質と考えられており、そこでは内膜の重要な構成成分であり、酸化的リン酸化(すなわち、ミトコンドリアのエネルギー代謝)、スーパーコンプレックス形成、タンパク質輸入、およびミトコンドリア動態、ミトファジー、およびアポトーシスに関与する11、12、13、14、15、16.TAFAZZINの機能喪失時に、CLリモデリングが失敗し、BTHS患者のミトコンドリアに特異的なリン脂質異常が生じる:成熟CLレベル(CLm)が低下し、一方、モノリソカルジオリピン(MLCL)および変化したCLアシル組成物(すなわち、未成熟CL種、CLi)のレベルの増加が起こる。これにより、MLCL/CL比17が劇的に上昇します。
BTHSの診断は、障害が非常に可変的な臨床的および生化学的特徴を示し、同じ家族の罹患した個人間および時間の経過とともに患者内で異なる可能性があるため、しばしば困難である3,5。多くのBTHSの男の子は、3-メチルグルタコン酸(3-MGCA)の尿中排泄の非常に高いレベルを示していますが、尿中レベルは正常であるか、時間の経過とともに患者ではわずかにしか増加しません3。しかし、3-MGCAの増加は、3-メチルグルタコニル-CoAヒドラターゼ欠損症(AUH欠損症)、3-メチルグルタコン酸尿症、ジストニア – 難聴、脳症、リー様(MEGDEL)症候群、コストフ症候群、および運動失調症を伴う拡張型心筋症(DCMA)症候群などの、他の様々なミトコンドリアおよび非ミトコンドリア障害の特徴である18,19.したがって、BTHSのマーカーとしての3-MCGAの特異性が低く、患者のばらつきが大きいため、生化学的診断は曖昧になります。
さらに、120種類以上のTAFAZZIN変異が障害5 を引き起こすことが記載されているため、遺伝子診断は複雑で、遅く、高価になる可能性があります。さらに、TAFAZIN遺伝子の分子分析は、非コード配列または調節配列3における変異の存在において偽陰性の結果をもたらし得る。BTHSは、(モノリソ)CL種の相対量および分布を決定することによって明確に試験することができ、TAFAZZIN遺伝子シーケンシングによって、またはその逆によって確認することができる。
診断のための実用的なテストは、血液スポット20,21における高速液体クロマトグラフィー(HPLC)およびエレクトロスプレーイオン化/質量分析(ESI/MS)分析によるMLCL/CL比の測定である。CLレベルのみを測定することは、一部の患者がCLのほぼ正常レベルを有するがMLCL/CL比が変化しているため、診断には不十分である。したがって、MLCL/CL比の測定は、BTHS診断に対して100%の感度および特異度を有する21。白血球22では、HPLCおよびESI/MS分析に基づく別の検証方法がセットアップされていますが、以前に抽出された脂質を分離するための複雑なクロマトグラフィー技術と機器の高価さにより、この分析はいくつかの臨床検査室に限定されています。これらすべての要因は、簡単な診断テストの欠如とともに、状態の過小診断に寄与している。
MALDI−TOF/MSは、脂質分析23,24においてさらに有効なツールである。この分析技術は、様々な生物学的試料の脂質プロファイルを直接取得するために使用することができ、したがって、MSイメージングアプリケーション30のための組織切片を含む抽出および分離ステップ25、26、27、28、29をスキップする。この利点を考慮して、無傷の白血球中のミトコンドリアCLをMALDI−TOF/MSでプロファイリングすることによってBTHSを診断する簡単で迅速な方法が開発された28。赤血球沈降および溶解によるわずか1mLの全血からの白血球単離は簡単で、特別な装置または試薬を必要としない。さらに、微量の白血球に適用可能な高速脂質「ミニ抽出」プロトコルは、無傷の白血球から得られたものよりも高い信号対雑音比(S/N)を有するよりクリーンなMS信号を有するスペクトルの獲得の成功を保証することが記載された28。このさらなるステップは、ほとんど時間がかかりませんし、感度の低いMS機器で実施した場合でも分析を再現することができます。要約すると、ここで説明する分析方法は、時間と労力のかかるクロマトグラフィー脂質分離をスキップできるため、最小限のサンプル調製しか必要とせず、それによって試験をスピードアップします。
Protocol
Representative Results
Discussion
バース症候群は、先天的な代謝の誤りであり、過小診断される可能性が高い人生を変える状態である2,6。前述のように、直接的な診断テストの欠如が要因である可能性があります。ここでは、BTHSスクリーニングのために白血球中のMALDI−TOF/MSによってMLCL/CL比を測定するための簡便かつ迅速な方法が記載された。さらに、MALDI-TOF質量分析計は世?…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちの研究に参加してくださったBTHSの個人とその家族に感謝しています。我々は、バース症候群財団米国及びバース症候群UKトラストの支援及びブリストルでの年次総会における血液サンプルの採取を支援してくれたことに感謝します。この研究は、Barth Syndrome Foundation US、Barth Italia Onlus、およびApulia Regionから資金提供を受けた。
Materials
| 1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 710335 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 878130 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate | Avanti Polar Lipids | 830845 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol) | Avanti Polar Lipids | 840445 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840033 | Lipid standard for MALDI-TOF calibration |
| 2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 190764 | |
| 9-Aminoacridine hemihydrate, 98% | Acros Organics | 134410010 | |
| Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 360457 | |
| Chloroform, ACS reagent, ≥99.8% | Merck Life Science S.r.l. | 319988 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
| Flex Analysis 3.3 | Bruker Daltonics | Software | |
| MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
| Microsoft Excel | Microsoft Office | Software | |
| OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
| Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
| Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |
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