היישום של גישות מבוססות חיפוש פתוח לזיהוי של Acinetobacter baumannii O מקושר Glycopeptides

גליקוסילציה של חלבון, תהליך הצמדת פחמימות למולקולות חלבון, הוא אחד השינויים הנפוצים ביותר לאחר התרגום (PTMs) בטבע ^1,2. בכל תחומי החיים התפתח מגוון של מכונות מורכבות המוקדשות לדור הגליקופרוטאינים המשפיעים על מספר עצום של פונקציות תאיות ^1,3,4,5. בעוד גליקוסילציה חלבון מתרחשת על מגוון של חומצות אמינו ^6,7, N מקושר ו O הקשורים Glycosylation אירועים הם שתי צורות דומיננטיות שנצפו בטבע. גליקוסילציה הקשורה ל- N כרוכה בחיבור של גליקנים לאטום חנקן של שאריות אספרגין (Asn), ואילו בגליקוזילציה המקושרת ל- O, הגליקנים מחוברים לאטום חמצן של סרין (Ser), תרונין (Thr) או טירוזין (Tyr) שאריות⁷. למרות הדמיון בשאריות הממוקדות על ידי מערכות גליקוסילציה, ההבדלים בתוך הגליקנים המחוברים לחלבונים גורמים לגליקוזילציה להיות המעמד המגוון ביותר מבחינה כימית של PTMs שנמצא בטבע.

בעוד שלמערכות הגליקוסילציה האוקריוטית יש מגוון גליקן, מערכות אלה מוגבלות בדרך כלל במספר הפחמימות הייחודיות המנוצלות. המגוון המתקבל נובע מהאופן שבו פחמימות אלה מסודרות בגליקנים 8,9,10,10,11,12. לעומת זאת, מינים חיידקיים וארכאיים בעלי מגוון גליקנים כמעט בלתי מוגבל בשל המערך העצום של סוכרים ייחודיים הנוצרים בתוך מערכות אלה 2,10,13,14,15,16,17. הבדלים אלה במגוון הגליקנים שנצפו בתחומי החיים מייצגים אתגר אנליטי משמעותי לאפיון ולזיהוי של אירועי גליקוזילציה. עבור גליקוסילציה אאוקריוטית, היכולת לצפות קומפוזיציות גליקן הקל על העניין הגובר בגליקוביולוגיה; עם זאת, אותו הדבר אינו נכון לגבי גליקוזיליה חיידקית, אשר עדיין מוגבלת במידה רבה למחקר על ידי מעבדות מיוחדות. ככל שהנגישות של מכשור ספקטרומטריית המסה (MS) גדלה במדעי הביולוגיה, גישות מבוססות טרשת נפוצה הן כעת השיטה העיקרית לניתוח גליקופרוטומי.

טרשת נפוצה התגלתה ככלי המובהק לאפיון הגליקוזילציה, עם גישות מלמעלה למטה ומלמטה למעלה המשמשות כיום לאפיון גליקופרוטאינים⁶. בעוד פרוטאומיקה מלמעלה למטה משמשת להערכת דפוסי גליקוסילציה גלובליים של חלבונים ספציפיים^18,19, גישות מלמטה למעלה משמשות כדי לאפשר אפיון ספציפי לגליקן של גליקופפטידים, אפילו מתערובות מורכבות ^{6,20,21,22,23}. לניתוח של גליקופפטידים, הדור של מידע פיצול אינפורמטיבי חיוני לאפיון אירועי גליקוסילציה^24,25. מגוון גישות פיצול נגישות כעת באופן שגרתי במכשירים, כולל דיסוציאציה מבוססת התנגשות מבוססת התנגשות מבוססת תהודה יון (IT-CID), דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות מסוג קרן (CID) ודיסוציאציה של העברת אלקטרונים (ETD). לכל גישה יש עוצמות וחולשות שונות לניתוח גליקופפטידים^25,26, עם התקדמות משמעותית בעשור האחרון ביישום גישות פיצול אלה לניתוח גליקוסילציה ^6,20. עם זאת, עבור ניתוח גליקוסילציה חיידקי, המגבלה הקריטית לא הייתה היכולת לפצל גליקופפטידים אלא חוסר היכולת לחזות את הרכבי הגליקאן הפוטנציאליים בתוך דגימות. בתוך מערכות אלה, הטבע הלא ידוע של גלייקנים חיידקיים מגוונים מגביל את הזיהוי של גליקופפטידים, אפילו עם כלי חיפוש ממוקדי גליקוסילציה כיום נפוץ לניתוח של גליקופפטידים אוקריוטיים, כגון O-Pair²⁷, GlycopeptideGraphMS²⁸, ו GlycReSoft²⁹. כדי להתגבר על בעיה זו, נדרשת שיטת חיפוש חלופית, עם שימוש בכלי חיפוש פתוחים המתעוררים כגישה רבת עוצמה לחקר הגליקוזילציה החיידקית³⁰.

חיפוש פתוח, הידוע גם בשם חיפוש עיוור או כללי, מאפשר זיהוי של פפטידים עם PTMs לא ידועים או בלתי צפויים 21,30,31,32. חיפושים פתוחים משתמשים במגוון טכניקות חישוביות, כולל חיפושי שינויים שאצרו, חיפושים במסדי נתונים מרובי שלבים או חיפוש סובלני בעל מסה רחבה 33,34,35,35,36,37. למרות שלחיפוש פתוח יש פוטנציאל גדול, השימוש בו בדרך כלל הופרע על ידי העלייה המשמעותית בזמני הניתוח ואובדן הרגישות לגילוי פפטידים שלא השתנו בהשוואה לחיפושים מוגבלים^31,32. הירידה בזיהוי התאמות פפטיד-ספקטרלי (PSMs) שלא השתנו היא תוצאה של שיעורי PSM חיוביים כוזבים הקשורים לטכניקות אלה, הדורשים סינון קפדני מוגבר כדי לשמור על שיעורי הגילוי השגויים הרצויים (FDRs)33,34,35,35,36,37 . לאחרונה, מספר כלים הפכו זמינים המשפרים באופן משמעותי את הנגישות של חיפוש פתוח, כולל Byonic^31,38, Open-pFind³⁹, ANN-SoLo⁴⁰, ו- MSFragger ^21,41. כלים אלה מאפשרים זיהוי חזק של אירועי גליקוסילציה על ידי צמצום משמעותי של זמני הניתוח ויישום גישות לטיפול בהרכבי גליקן הטרוגניים.

מאמר זה מציג שיטה יעילה לזיהוי גליקופפטידים חיידקיים על ידי חיפוש פתוח, באמצעות פתוגן נוסוקומי שלילי גרם, Acinetobacter baumannii, כמודל. A. baumannii בעל מערכת גליקוזילטציה מקושרת O משומרת האחראית לשינוי של מצע חלבונים מרובים, המכונה מערכת גליקוזילציה חלבון PglL 42,43,44^. בעוד חלבונים דומים מיועדים לגליקוזילציה בין זנים, מערכת הגליקוזילציה PglL משתנה מאוד בשל הביוסינתזה של הגליקן המשמש לגליקוזילציה של חלבון המופקת מהלוקוס של הקפסולה (המכונה K-locus)^44,45,46. התוצאה היא גליקנים מגוונים (הידוע גם בשם K-יחידה), נגזר יחיד או מוגבל K-יחידות פולימריות, מתווסף מצע חלבון 30,44,46. במסגרת עבודה זו, השימוש בכלי החיפוש הפתוח, MSfragger, בתוך התוכנה FragPipe, משמש לזיהוי גליקנים על פני זני A. baumannii. על ידי שילוב של חיפוש פתוח ואוצרות ידנית, ניתן לבצע “חיפושים ממוקדי גליקנים” כדי לשפר עוד יותר את הזיהוי של גליקופפטידים חיידקיים. יחד, גישה זו לזיהוי רב-שלבי מאפשרת זיהוי של גליקופפטידים ללא ניסיון רב באפיון אירועי גליקוסילציה חדשניים.