アシネトバクター・バウマンニO結合型糖ペプチドの同定のためのオープンサーチに基づくアプローチの適用

タンパク質グリコシル化は、タンパク質分子に炭水化物を結合させるプロセスであり、自然界で最も一般的な翻訳後修飾(PTM)の^{1つである1,2}。生命のすべての領域にわたって、無数の細胞機能に影響を与える糖タンパク質の生成に特化した一連の複雑な機械が進化してきました^1,3,4,5。タンパク質グリコシル化はアミノ酸^6、7の範囲で起こるが、N結合型およびO結合型グリコシル化事象は、自然界で観察される2つの支配的な形態である。N結合型グリコシル化は、アスパラギン(Asn)残基の窒素原子へのグリカンの結合を伴うが、O結合型グリコシル化において、グリカンは、セリン(Ser)、スレオニン(Thr)、またはチロシン(Tyr)残基の酸素原子に結合している⁷。グリコシル化系によって標的とされる残基の類似性にもかかわらず、タンパク質に結合しているグリカン内の相違により、グリコシル化は自然界で見出されるPTMの最も化学的に多様なクラスである。

真核生物グリコシル化系はグリカンの多様性を有するが、これらの系は典型的には、利用される固有の炭水化物の数に制限されている。結果として生じる多様性は、これらの炭水化物がグリカン⁸、⁹、^10、11、12にどのように配置されるかに由来する。対照的に、細菌および古細菌種は、これらの系内で生成されるユニークな糖の膨大な配列のために、事実上無限のグリカン多様性を有する²、^10、13、¹⁴、^15、16、17。生命のドメイン間で観察されるグリカン多様性のこれらの違いは、グリコシル化事象の特性評価および同定のための重要な分析上の課題を表す。真核生物のグリコシル化の場合、グリカン組成物を予測する能力は、糖生物学への関心の高まりを促進してきた。しかし、細菌のグリコシル化についても同じことは当てはまらず、専門の研究室による研究にはまだ大きく制限されています。バイオサイエンスにおいて質量分析(MS)機器のアクセシビリティが高まるにつれて、MSベースのアプローチがグリコプロテオーム分析の主要な方法になりました。

MSはグリコシル化の特性評価のための典型的なツールとして浮上しており、トップダウンとボトムアップの両方のアプローチが糖タンパク質⁶の特性評価に一般的に使用されています。トップダウンプロテオミクスは、特定のタンパク質のグローバルなグリコシル化パターンを評価するために使用されるが^18,19、ボトムアップアプローチは、複雑な混合物⁶、20、21、²²、²³からでさえも、糖ペプチドのグリカン特異的特性評価を可能にするために使用される。糖ペプチドの分析のためには、有益な断片化情報の生成が、グリコシル化事象の特性評価に不可欠である^24、25。現在、共鳴イオントラップベースの衝突誘起解離(IT-CID)、ビーム型衝突誘起解離(CID)、電子移動解離(ETD)など、さまざまなフラグメンテーションアプローチが機器で日常的にアクセス可能です。各アプローチは、糖ペプチド分析^25,26に対して異なる長所と短所を有しており、これらの断片化アプローチをグリコ^{シル化6,20}の分析に適用する上で過去¹⁰年間で著しい進歩を遂げている。しかし、細菌のグリコシル化分析にとって、重要な制限は糖ペプチドを断片化する能力ではなく、むしろサンプル内の潜在的なグリカン組成を予測できないことでした。これらのシステム内では、多様な細菌グリカンの未知の性質は、O-Pair²⁷、GlycopeptideGraphMS²⁸、およびGlycReSoft²⁹などの真核生物糖ペプチドの分析のために現在一般的であるグリコシル化に焦点を当てた検索ツールを使用しても、糖ペプチドの同定を制限する。この問題を克服するためには、細菌のグリコシル化³⁰の研究のための強力なアプローチとして、オープンな検索ツールの使用が浮上している代替の検索方法が必要である。

オープン検索は、ブラインドまたはワイルドカード検索としても知られており、不明または予期しないPTM²¹、^30、31、32を有するペプチドの同定を可能にする。オープン検索は、キュレーションされた修正検索、多段階データベース検索、または広質量耐性検索33、34、³⁵、^36、37を含む様々な計算技術を利用する。オープン検索は大きな可能性を秘めているが、その使用は、典型的には、制限された検索と比較して、分析時間の有意な増加および非修飾ペプチドの検出の感度の損失によって妨げられてきた^31、32。非修飾ペプチドスペクトルマッチ(PSM)の検出の減少は、これらの技術に関連する偽陽性PSM率の増加の結果であり、所望の偽発見率(FDR)を維持するためには、より厳格なフィルタリングの増加が必要である33、³⁴、³⁵、^36、37.最近、Byonic 31,38、Open-pFind³⁹、ANN-SoLo 40、MSFragger^21,41など、オープン検索のアクセシビリティを大幅に向上させるいくつかのツールが利用可能になりました。これらのツールは、分析時間を大幅に短縮し、不均一なグリカン組成物を処理するためのアプローチを実装することによって、グリコシル化イベントの堅牢な同定を可能にします。

本稿では、グラム陰性院内病原体であるアシネトバクター・バウマンニをモデルとして、オープンサーチによる細菌糖ペプチドの同定のための合理化された方法を提示する。A. baumanniiは、PglLタンパク質グリコシル化システム42、⁴³、⁴⁴として知られる複数のタンパク質基質の修飾に関与する保存されたO結合型グリコシル化システム^{を有する。}類似のタンパク質が株間のグリコシル化を標的としているが、PglLグリコシル化システムは、タンパク質グリコシル化に使用されるグリカンの生合成がカプセル遺伝子座(K遺伝子座として知られている)に由来するため、非常に可変である^44,45,46。これは、単一または限定された重合K単位に由来する多様なグリカン(K単位としても知られる)を、タンパク質基質³⁰、^44、46に付加する結果とする。この研究の中で、ソフトウェアFragPipe内のオープン検索ツールMSfraggerの使用は、A. baumannii株全体のグリカンを同定するために使用される。オープン検索と手作業によるキュレーションを組み合わせることで、「糖鎖に着目した探索」を行い、細菌の糖ペプチドの同定をさらに向上させることができます。一緒に、この多段階同定アプローチは、新規グリコシル化事象の特性評価において広範な経験なしに糖ペプチドの同定を可能にする。