A aplicação de abordagens baseadas em pesquisa aberta para a identificação de Glycopeptides ligados ao Acinetobacter baumannii O

A glicossomilação proteica, o processo de anexação de carboidratos a moléculas de proteínas, é uma das modificações pós-translacionais mais comuns (PTMs) na natureza ^1,2. Em todos os domínios da vida, uma gama de máquinas complexas evoluiu dedicada à geração de glicoproteínas que impactam uma miríade de funções celulares 1,3,4,5. Enquanto a glicossilation proteica ocorre em uma gama de aminoácidos ^6,7, eventos de glicosylation ligados a N são duas formas dominantes observadas na natureza. A glicosylação ligada a N envolve a fixação de glicocanos a um átomo de nitrogênio de resíduos de asparagine (Asn), enquanto na glicosylação ligada a O, os glicanos são ligados a um átomo de oxigênio de^{resíduos de} serina (Ser), threonine (Thr) ou tyrosine (Tyr). Apesar das semelhanças nos resíduos visados pelos sistemas de glicoseção, as diferenças dentro dos glicanos ligados às proteínas resultam na glicossylation sendo a classe mais quimicamente diversificada de PTMs encontrados na natureza.

Embora os sistemas de glicoseção eucariótica possuam diversidade glican, esses sistemas são tipicamente restritos no número de carboidratos únicos utilizados. A diversidade resultante decorre da forma como esses carboidratos são dispostos em glicanos 8,9,10,11,12. Em contraste, as espécies bacterianas e arqueais possuem uma diversidade glican praticamente ilimitada devido à pura variedade de açúcares únicos gerados nesses sistemas 2,10,13,14,15,16,17. Essas diferenças na diversidade glican observada entre os domínios da vida representam um desafio analítico significativo para a caracterização e identificação dos eventos de glicosylation. Para a glicosylation eucariótica, a capacidade de antecipar composições glican facilitou o crescente interesse pela glicobiologia; no entanto, o mesmo não se aplica à glicossylation bacteriana, que ainda é amplamente restrita ao estudo por laboratórios especializados. Como a acessibilidade da instrumentação da espectrometria de massa (MS) aumentou nas biociências, as abordagens baseadas em MS são agora o principal método para análise glicoproteômica.

A ESM emergiu como a ferramenta quintessencial para a caracterização da glicosylation, com abordagens de cima para baixo e de baixo para cima agora comumente usadas para caracterizar glicoproteínas⁶. Enquanto a proteômica de cima para baixo é usada para avaliar padrões globais de glicosylação de proteínas específicas^18,19, abordagens de baixo para cima são usadas para permitir a caracterização glican-específica de glicaptocidas, mesmo a partir de misturas complexas ^{6,20,21,22,23}. Para a análise dos glicacopeptídeos, a geração de informações informativas de fragmentação é essencial para a caracterização dos eventos de glicossylation^24,25. Uma série de abordagens de fragmentação agora é rotineiramente acessível em instrumentos, incluindo dissociação induzida por colisão baseada em ressonância ion trap (TI-CID), dissociação induzida por colisão do tipo feixe (CID) e dissociação de transferência de elétrons (ETD). Cada abordagem possui diferentes pontos fortes e fracos para a análise de glicocopepcida^25,26, com progresso significativo na última década na aplicação dessas abordagens de fragmentação para analisar a glicosylação ^6,20. No entanto, para a análise da glicostilação bacteriana, a limitação crítica não tem sido a capacidade de fragmentar glycopeptídeos, mas sim a incapacidade de prever as potenciais composições glica dentro das amostras. Dentro desses sistemas, a natureza desconhecida de diversos glicanos bacterianos limita a identificação de glicocopeptídeos, mesmo com ferramentas de busca focadas em glicosylation agora comuns para a análise de glicoptodides eucarióticos, como O-Par²⁷, GlycopeptideGraphMS²⁸ e GlycReSoft²⁹. Para superar essa questão, é necessário um método alternativo de busca, com o uso de ferramentas de busca aberta emergindo como uma abordagem poderosa para o estudo da glicosylation bacteriana³⁰.

A busca aberta, também conhecida como busca de curinga, permite a identificação de peptídeos com PTMs desconhecidos ou inesperados 21,30,31,32. Pesquisas abertas utilizam uma variedade de técnicas computacionais, incluindo pesquisas de modificação com curadoria, pesquisas de banco de dados multicamados ou pesquisa tolerante em larga massa 33,34,35,36,37. Embora a busca aberta tenha grande potencial, seu uso tem sido tipicamente dificultado pelo aumento significativo dos tempos de análise e perda de sensibilidade da detecção de peptídeos não modificados em comparação com pesquisas restritas^31,32. A diminuição na detecção de partidas espectrais de peptídeos não modificados (PSMs) é resultado do aumento das taxas de PSM falso-positivo associadas a essas técnicas, o que requer uma filtragem rigorosa aumentada para manter as taxas de falsas descobertas desejadas (FDRs)33,34,35,36,37 . Recentemente, várias ferramentas se tornaram disponíveis que melhoram significativamente a acessibilidade da pesquisa aberta, incluindo Byonic^31,38, Open-pFind³⁹, ANN-SoLo⁴⁰ e MSFragger^21,41. Essas ferramentas permitem a identificação robusta de eventos de glicosylation, reduzindo significativamente os tempos de análise e implementando abordagens para lidar com composições glicas heterogêneas.

Este artigo apresenta um método simplificado para a identificação de glicoptocidas bacterianos por busca aberta, utilizando como modelo o patógeno nosocomial Gram-negativo, Acinetobacter baumannii. A. baumannii possui um sistema de glicoslação orientado ligado a O responsável pela modificação de múltiplos substratos proteicos, conhecido como sistema de glicoslação de proteínas^PGLL 42,43,44. Embora proteínas semelhantes sejam destinadas à glicosylation entre cepas, o sistema de glicosylation pglL é altamente variável devido à biossíntese do glicano usado para glicossite de proteínas derivadas do locus cápsula (conhecido como K-locus)44,45,46. Isso resulta em diversos glicocanos (também conhecidos como unidade K), derivados de unidades K polimerizadas únicas ou limitadas, sendo adicionados a substratos proteicos 30,44,46. Dentro deste trabalho, o uso da ferramenta de pesquisa aberta, MSfragger, dentro do software FragPipe, é usado para identificar glycans em cepas A. baumannii. Combinando buscas abertas e curadoria manual, “pesquisas focadas em glycan” podem ser realizadas para melhorar ainda mais a identificação de glycopeptídeos bacterianos. Em conjunto, essa abordagem de identificação multistep permite a identificação de glycopeptídeos sem ampla experiência na caracterização de novos eventos de glicosylação.