Acinetobacter baumannii O-bağlantılı Glikopeptitlerlerin Tanımlanması için Açık Arama Tabanlı Yaklaşımların Uygulanması

Karbonhidratların protein moleküllerine bağlanma işlemi olan protein glikozilasyonu, doğada en yaygın post-translasyonel modifikasyonlardan (PTM’ler) biridir ^1,2. Yaşamın tüm alanlarında, sayısız hücresel fonksiyonu etkileyen glikoproteinlerin üretimine adanmış bir dizi karmaşık makine gelişmiştir ^1,3,4,5. Protein glikozilasyonu^bir dizi amino asit ^6,7 üzerinde meydana gelirken^, N’ye bağlı ve O’ya bağlı glikozilasyon olayları doğada gözlenen iki baskın formdur. N’ye bağlı glikozilasyon, glikanların asparagin (Asn) kalıntılarının bir azot atomuna bağlanmasını içerirken, O’ya bağlı glikozilasyonda, glikanlar serin (Ser), treonin (Thr) veya tirozin (Tyr) kalıntılarının bir oksijen atomuna bağlanır⁷. Glikozilasyon sistemleri tarafından hedeflenen kalıntılardaki benzerliklere rağmen, proteinlere bağlı glikanlar içindeki farklılıklar, glikozilasyonun doğada bulunan PTM’lerin kimyasal olarak en çeşitli sınıfı olmasına neden olur.

Ökaryotik glikozilasyon sistemleri glikan çeşitliliğine sahipken, bu sistemler tipik olarak kullanılan benzersiz karbonhidrat sayısında sınırlıdır. Ortaya çıkan çeşitlilik, bu karbonhidratların^glikanlara nasıl düzenlendiğinden kaynaklanmaktadır 8,9,10,11,12. Buna karşılık, bakteri ve arkeal türler, bu sistemlerde üretilen benzersiz şekerlerin çok çeşitli^olması nedeniyle neredeyse sınırsız glikan çeşitliliğine sahiptir 2,10,13,14,15,16,17. Yaşam alanları arasında gözlenen glikan çeşitliliğindeki bu farklılıklar, glikozilasyon olaylarının karakterizasyonu ve tanımlanması için önemli bir analitik zorluğu temsil etmektedir. Ökaryotik glikozilasyon için, glikan bileşimlerini tahmin etme yeteneği, glikobiyolojiye artan ilgiyi kolaylaştırmıştır; Bununla birlikte, aynı şey, hala büyük ölçüde uzmanlaşmış laboratuvarlar tarafından çalışılmakla sınırlı olan bakteriyel glikozilasyon için geçerli değildir. Biyobilimlerde kütle spektrometresi (MS) enstrümantasyonunun erişilebilirliği arttıkça, MS tabanlı yaklaşımlar artık glikoproteomik analiz için birincil yöntemdir.

MS, glikozilasyonun karakterizasyonu için mükemmel bir araç olarak ortaya çıkmıştır ve hem yukarıdan aşağıya hem de aşağıdan yukarıya yaklaşımlar şimdi glikoproteinleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır⁶. Yukarıdan aşağıya proteomikler, spesifik proteinlerin^18,19 küresel glikozilasyon paternlerini değerlendirmek için kullanılırken, aşağıdan yukarıya yaklaşımlar, glikopeptidlerin glikana özgü karakterizasyonunu sağlamak için, karmaşık karışımlardan bile^{6,20,21,22,23} kullanılır. Glikopeptidlerin analizi için, bilgilendirici parçalanma bilgisinin üretilmesi, glikozilasyon olaylarının karakterizasyonu için gereklidir^24,25. Rezonans iyon tuzağına dayalı çarpışma kaynaklı ayrışma (IT-CID), ışın tipi çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) ve elektron transferi ayrışması (ETD) dahil olmak üzere bir dizi parçalanma yaklaşımına artık aletler üzerinde rutin olarak erişilebilir. Her yaklaşım, glikopeptid analizi 25,26 için farklı güçlü ve zayıf yönlere sahiptir ve son on yılda bu parçalanma yaklaşımlarının glikozilasyonu analiz etmek için uygulanmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir ^6,20. Bununla birlikte, bakteriyel glikozilasyon analizi için kritik sınırlama, glikopeptidleri parçalama yeteneği değil, numuneler içindeki potansiyel glikan bileşimlerini tahmin edememe olmuştur. Bu sistemlerde, çeşitli bakteriyel glikanların bilinmeyen doğası, O-Pair²⁷, GlycopeptideGraphMS²⁸ ve GlycReSoft²⁹ gibi ökaryotik glikopeptidlerin analizi için artık yaygın olan glikozilasyon odaklı arama araçlarıyla bile, glikopeptidlerin tanımlanmasını sınırlar. Bu sorunun üstesinden gelmek için, bakteriyel glikozilasyon çalışması için güçlü bir yaklaşım olarak ortaya çıkan açık arama araçlarının kullanımı ile alternatif bir arama yöntemi gereklidir³⁰.

Kör veya joker karakter arama olarak da bilinen açık arama, bilinmeyen veya beklenmeyen ^PTM’lere sahip peptitlerin tanımlanmasına izin verir 21,30,31,32. Açık aramalar, seçilmiş değişiklik aramaları, çok adımlı veritabanı aramaları veya geniş kütle toleranslı arama^{33,34,35,36,37} dahil olmak üzere çeşitli hesaplama tekniklerini kullanır. Açık arama büyük bir potansiyele sahip olmasına rağmen, kullanımı tipik olarak, analiz sürelerindeki önemli artış ve sınırlı aramalara kıyasla değiştirilmemiş peptitlerin tespitindeki hassasiyet kaybı nedeniyle engellenmiştir^31,32. Modifiye edilmemiş peptid-spektral eşleşmelerin (PSM’ler) tespitindeki azalma, istenen yanlış keşif oranlarını (FDR’ler) korumak için artan sıkı filtreleme gerektiren bu tekniklerle ilişkili artan yanlış pozitif PSM oranlarının bir sonucudur 33,34,35,36,37 . Son zamanlarda, Byonic 31,38, Open-pFind³⁹, ANN-SoLo 40 ve MSFragger^21,41 dahil olmak üzere açık aramanın erişilebilirliğini önemli ölçüde artıran çeşitli araçlar kullanıma sunulmuştur. Bu araçlar, analiz sürelerini önemli ölçüde azaltarak ve heterojen glikan bileşimlerini işlemek için yaklaşımlar uygulayarak glikozilasyon olaylarının sağlam bir şekilde tanımlanmasını sağlar.

Bu makalede, Gram-negatif nozokomiyal patojen Acinetobacter baumannii’yi model olarak kullanarak, bakteriyel glikopeptidlerin açık arama yoluyla tanımlanması için kolaylaştırılmış bir yöntem sunulmaktadır. A. baumannii, PglL protein glikozilasyon sistemi^42,43,44 olarak bilinen çoklu protein substratlarının modifikasyonundan sorumlu korunmuş bir O-bağlantılı glikozilasyon sistemine sahiptir. Benzer proteinler suşlar arasında glikozilasyon için hedeflenirken, PglL glikozilasyon sistemi, kapsül lokusundan (K-lokus olarak bilinir) türetilen protein glikozilasyonu için kullanılan glikanın biyosentezi nedeniyle oldukça ^{değişkendir4,45,46}. Bu, tek veya sınırlı polimerize K-birimlerinden türetilen çeşitli glikanların (K-birimi olarak da bilinir) protein substratlarına ^30,44,46 eklenmesiyle sonuçlanır. Bu çalışmada, FragPipe yazılımı içindeki açık arama aracı MSfragger’ın kullanımı, A. baumannii suşları arasındaki glikanları tanımlamak için kullanılmıştır. Açık arama ve manuel kürasyonu birleştirerek, bakteriyel glikopeptidlerin tanımlanmasını daha da iyileştirmek için “glikan odaklı aramalar” yapılabilir. Birlikte, bu çok adımlı tanımlama yaklaşımı, yeni glikozilasyon olaylarının karakterizasyonunda geniş deneyime sahip olmadan glikopeptidlerin tanımlanmasını sağlar.