Acinetobacter baumannii O 결합 글리코 펩타이드의 확인을위한 개방형 검색 기반 접근법의 적용

단백질 분자에 탄수화물을 부착하는 과정인 단백질 글리코실화는 자연 ^1,2에서 가장 흔한 번역 후 변형(PTM) 중 하나입니다. 삶의 모든 영역에서 다양한 복잡한 기계가 무수한 세포 기능에 영향을 미치는 당단백질의 생성에 전념하여 진화했습니다 ^1,3,4,5. 단백질 글리코실화는 아미노산^6,7의 범위에서 발생하는 반면^, N-결합 및 O-연결된 글리코실화 이벤트는 자연에서 관찰되는 두 가지 우세한 형태이다. N-연결된 글리코실화는 아스파라긴(Asn) 잔기의 질소 원자에 글리칸의 부착을 수반하는 반면, O-연결된 글리코실화에서, 글리칸은 세린(Ser), 트레오닌(Thr), 또는 티로신(Tyr) 잔기⁷의 산소 원자에 부착된다. 글리코실화 시스템에 의해 표적화된 잔기의 유사성에도 불구하고, 단백질에 부착된 글리칸 내의 차이는 글리코실화가 자연에서 발견되는 PTM의 가장 화학적으로 다양한 부류임을 초래한다.

진핵 글리코실화 시스템은 글리칸 다양성을 보유하지만, 이들 시스템은 전형적으로 이용되는 독특한 탄수화물의 수에서 제한된다. 그 결과 다양성은 이러한 탄수화물이 글리 칸 8,9,10,11,12로 배열되는 방식에서 비롯됩니다. 대조적으로, 박테리아 및 고세균 종은 이러한 시스템^내에서 생성 된 독특한 설탕의 깎아 지른 배열로 인해 사실상 무제한의 글리 칸 다양성을 가지고 있습니다 2,10,13,14,15,16,17. 생명의 영역에 걸쳐 관찰된 글리칸 다양성의 이러한 차이는 글리코실화 사건의 특성화 및 확인에 대한 중요한 분석적 도전을 나타낸다. 진핵 글리코실화의 경우, 글리칸 조성물을 예측하는 능력은 글리코생물학에 대한 관심의 증가를 촉진시켰다; 그러나 박테리아 글리코실화에 대해서도 마찬가지이며, 이는 여전히 전문 실험실의 연구로 크게 제한됩니다. 생명 과학에서 질량 분광법 (MS) 계측의 접근성이 증가함에 따라 MS 기반 접근법은 이제 글리코 프로테오믹 분석의 주요 방법입니다.

MS는 글리코실화의 특성화를 위한 전형적인 도구로서 등장하였으며, 현재 당단백질⁶을 특성화하기 위해 하향식 및 상향식 접근법 둘 다 일반적으로 사용되고 있다. 하향식 프로테오믹스는 특정 단백질^18,19의 글로벌 글리코실화 패턴을 평가하기 위해 사용되는 반면, 상향식 접근법은 복합 혼합물^{6,20,21,22,23}에서도 글리칸 특이적 글리코펩티드의 특성화를 가능하게 하기 위해 사용된다. 글리코펩티드의 분석을 위해, 유익한 단편화 정보의 생성은 글리코실화 사건^24,25의 특성화에 필수적이다. 공진 이온 트랩 기반 충돌 유도 해리(IT-CID), 빔형 충돌 유도 해리(CID) 및 전자 전달 해리(ETD)를 포함한 다양한 단편화 접근법이 기기에서 일상적으로 접근 가능합니다. 각 접근법은 글리코펩티드 분석 25,26에 대해 서로 다른 강점과 약점을 가지고 있으며, 글리코실화 ^6,20을 분석하기 위해 이러한 단편화 접근법을 적용하는 데 지난 십 년 동안 상당한 진전이 있었다. 그러나, 박테리아 글리코실화 분석의 경우, 중요한 한계는 글리코펩티드를 단편화하는 능력이 아니라 샘플 내에서 잠재적인 글리칸 조성물을 예측할 수 없다는 것이었다. 이러한 시스템 내에서, 다양한 박테리아 글리칸의 알려지지 않은 성질은 글리코펩티드의 식별을 제한하며, 심지어 글리코실화에 초점을 맞춘 검색 도구는 현재 O-Pair²⁷, GlycopeptideGraphMS 28 및 GlycReSoft²⁹와 같은 진핵 글리코펩티드의 분석을 위해 흔히 사용되고 있다. 이 문제를 극복하기 위해, 박테리아 글리코실화³⁰의 연구를 위한 강력한 접근법으로 떠오르는 오픈 서닝 도구의 사용과 함께 대안적인 검색 방법이 요구된다.

블라인드 또는 와일드카드 검색이라고도 하는 개방형 검색은 알 수 없거나 예기치 않은 PTM 21,30,31,32를 가진 펩티드를 식별할 수 있게 합니다. 개방형 검색은 큐레이팅된 수정 검색, 다단계 데이터베이스 검색 또는 광질량 내성 검색(^{33,34,35,36,37})을 포함하는 다양한 계산 기술을 활용합니다. 오픈 서빙은 큰 잠재력을 가지고 있지만, 그의 사용은 전형적으로 제한된 검색(^31,32)에 비해 변형되지 않은 펩티드의 검출에 대한 분석 시간의 현저한 증가 및 민감도의 손실에 의해 방해를 받았다. 변형되지 않은 펩티드-스펙트럼 매칭(PSMs)의 검출의 감소는 이들 기술과 관련된 위양성 PSM 비율의 증가의 결과이며, 이는 원하는 거짓 발견률(FDR)을 유지하기 위해 증가된 엄격한 필터링을 필요로 한다(FDR)^{33,34,35,36,37} . 최근에는 Byonic 31,38, Open-pFind³⁹, ANN-SoLo 40 및 MSFragger ^21,41을 포함하여 공개 검색의 접근성을 크게 향상시키는 몇 가지 도구가 제공되었습니다. 이러한 도구는 분석 시간을 현저하게 줄이고 이종 글리칸 조성물을 처리하기 위한 접근법을 구현함으로써 글리코실화 이벤트의 강력한 식별을 가능하게 한다.

이 글은 그람 음성 병원체인 아시네토박터 바우마니이를 모델로 사용하여 열린 탐색에 의한 박테리아 글리코펩티드의 동정을 위한 간소화된 방법을 제시한다. A. baumannii는 PglL 단백질 글리코실화 시스템^42,43,44로 알려진 다중 단백질 기질의 변형을 담당하는 보존된 O-연결된 글리코실화 시스템을 보유한다. 유사한 단백질이 균주 간의 글리코실화를 표적으로 하는 반면, PglL 글리코실화 시스템은 캡슐 유전자좌(K-locus로 알려짐)로부터 유래되는 단백질 글리코실화에 사용되는 글리칸의 생합성으로 인해 매우 가변적이다(K-locus로 알려짐)^44,45,46. 이로 인해 단일 또는 제한된 중합된 K-단위로부터 유래된 다양한 글리칸(K-단위라고도 함)이 단백질 기질(^30,44,46)에 첨가된다. 이 작업에서 소프트웨어 FragPipe에서 열린 검색 도구 인 MSfragger를 사용하여 A. baumannii 균주에서 글리 칸을 식별하는 데 사용됩니다. 오픈 서치와 수동 큐레이션을 결합함으로써, 박테리아 글리코펩티드의 동정을 더욱 개선하기 위해 “글리칸 중심 검색”을 수행할 수 있다. 함께, 이러한 다단계 동정 접근법은 신규한 글리코실화 사건의 특성화에 대한 광범위한 경험 없이 글리코펩티드의 동정을 가능하게 한다.