Иммунофлуоресценция, очистка и многофотонная микроскопия цельных яичников для количественного 3D-анализа развивающегося овариального резерва у мышей

Большинство самок млекопитающих рождаются с конечным числом мейотически остановленных ооцитов, хранящихся в первичных фолликулах, составляющих овариальный резерв (OR)^1,2. ОПЕРАЦИОНН определяет общую продолжительность репродуктивной жизни и здоровье женщин³. ОПЕРАЦИОНН обычно уменьшается в размерах со старением и может быть преждевременно истощена при воздействии определенных генотоксических агентов (лучевая / химиотерапия) и экологических стрессов (недоедание), что приводит к бесплодию ^4,5,6. Идиопатическое женское бесплодие часто можно отнести к генетическому и физиологическому качеству яйцеклеток, развивающихся из ОПЕРАЦИОННОЙ и остающихся плохо изученными ^7,8. Поскольку эндаумент женских фолликулов в значительной степени предопределен рождением, важно понимать регуляторные механизмы, участвующие в создании и поддержании ОПЕРАЦИОННОЙ.

У мышей образование ОР начинается со спецификации первичных половых клеток (ПГК) вокруг эмбрионального дня (E) 7,5². PGC мигрируют в генитальные гребни, где они будут проживать примерно по E10.5⁹. Следующая обширная пролиферация происходит с неполным цитокинезом, что приводит к образованию кист, которые будут разрушены позже в развитии^10,11. Примерно при Е12,5 определяется пол гонад, и пролиферация PGC останавливается в яичниках. У женщин ПГК, в настоящее время ооциты, вводят мейотическую профазу I (MPI) примерно по E13,5^12,13. Ооциты прогрессируют через расширенный MPI и остановку на стадии диктиата во время рождения. В течение первой недели после рождения каждая арестованная яйцеклетка окружена гранулезными клетками, тем самым образуя примордиальный фолликул.

Количество первичных фолликулов в ОШ самки зависит от того, сколько ооцитов пережило волны элиминации ооцитов, возникающие до и во время остановки MPI через апоптоз, аутофагию или некроз^14,15. Первая волна возникает во время внутриутробного развития и известна как FOA. FOA – это эволюционно сохраненный процесс у самок (млекопитающих и немлекопитающих), в результате которого, по оценкам, 50-80% ооцитов удаляются в зависимости от женских видов 16,17,18,19. У мышей FOA происходит во время E15.5 до E18.5 и приписывается реактивации и экспрессии ретротранспозонных последовательностей LINE-1, вызывающих гибель ооцитов ^20,21. Вторая волна элиминации ооцитов происходит через мейотическую контрольную точку, которая устраняет ооциты с мейотическими дефектами, такими как невосстановленные двухцепочечные разрывы ДНК (DSBs)^22,23. Следующая волна элиминации ооцитов происходит во время распада кисты, кульминацией которой является образование примордиальных фолликулов, каждый из которых содержит единую яйцеклетку 10,11,24,25.

У мышей резерв примордиальных фолликулов в значительной степени устанавливается половым созреванием, после чего он уменьшается по мере активации первичных фолликулов для роста во время регулярных репродуктивных циклов. Размер ОПЕРАЦИОННОЙ варьируется среди отдельных женщин и среди различных генетических штаммов мышей; тем не менее, генетическая регуляция размера ОР не совсем понятна ^26,27,28,29. Генетическим исследованиям регуляции ОР препятствует отсутствие стандартизированных протоколов изучения волн элиминации ооцитов во время пренатального и постнатального развития. На мышах было разработано несколько методологий количественной оценки ооцитов, наиболее распространенной и широко используемой из которых является гистоморфометрическая оценка гистологических срезов^30,31. В этом методе ооциты идентифицируются на последовательных участках с гистологическими пятнами, такими как гематоксилин и эозин (H & E) и периодические кислоты-Шиффа (PAS) или флуоресцентные маркеры. Этот метод надежен, если все условия остаются постоянными, включая толщину сечения, эффективное восстановление всех участков по всему яичнику и схемы подсчета отдельных лабораторий. Однако цифры, сообщаемые различными лабораториями, часто значительно различаются и, следовательно, их нелегко сопоставить.

Кроме того, учитывая генетические различия, использование различных штаммов мышей также может влиять на количество ооцитов. Для гистоморфометрической оценки были разработаны дополнительные вычислительные подходы, включающие автоматическое обнаружение ооцитов с использованием фракционаторного подхода, автоматический подсчет с использованием вычислительных алгоритмов и 3D-реконструкцию гистологических изображений для предотвращения многократного подсчета одного и того же ооцита 31,32,33,34,35,36 . Даже с учетом этих улучшений, добавленных к гистоморфометрической оценке, метод является относительно трудоемким, особенно для крупномасштабных и высокопроизводительных исследований. Собранные данные могут быть невоспроизводимыми и сопоставимыми между исследованиями из-за различий в схемах подсчета, компьютерных алгоритмах и используемом программном обеспечении.

В последнее время, ускоренные разработкой новых методов многофотонной и световой листовой микроскопии среднего разрешения и оптического очищения тканей, методы 3D-моделирования и анализа интактных яичников становятся методом выбора для эффективной количественной оценки числа ооцитов и изучения локализации и динамики белка^37,38. Эти 3D-методы, как правило, выгодны по сравнению с гистологическими методами, поскольку ткани и органы лучше сохраняются и сохраняются нетронутыми. Кроме того, 3D-анализ и моделирование дают дополнительное представление о функциях и взаимодействиях внутри и между клеточными нишами или подструктурами в органе, которые могут быть пропущены в 2D-анализе.

3D-анализ целых органов требует оптимизации протоколов фиксации, иммуноокрашивания и оптического очищения для отдельных органов, таких как яичники, без искажения или повреждения тканей. Дополнительная оптимизация монтажа образца для визуализации требуется для микроскопии с высоким разрешением и может зависеть от доступной платформы визуализации. Наконец, визуализация всего неповрежденного яичника генерирует большое количество данных для последующего вычислительного анализа. Поэтому необходимо разработать стандартизированные 3D-методы подсчета ооцитов для сравнительных исследований и на разных стадиях развития.

Этот протокол использует стандартное иммуноокрашивание и ранее сообщенные протоколы очистки, ориентируясь на простой, удобный для пользователя и высокопроизводительный подход 38,39,40,41. Протокол оптимизирован для анализа большого количества пренатальных и постнатальных яичников до постнатального дня 28 (P28) и различных размеров яичников из разных генетических фонов мышей. Этапы иммуноразрашивания сходны для всех стадий; однако протоколы очистки различаются для пубертатных яичников из-за их большего размера, ScaleS4(0) и CUBIC для малых и больших яичников, соответственно^40,41. Кроме того, перфузия всего тела выполняется у мышей P28 перед фиксацией, чтобы предотвратить аутофлуоресценцию клеток крови. Многофотонный микроскоп был построен на платформе Leica DIVE/4Tune в качестве альтернативы световой листовой микроскопии для получения изображений, и для этого протокола было выбрано программное обеспечение IMARIS 3D Visualization and Analysis с различными аналитическими инструментами. Этот протокол прост в использовании и менее практичен, что экономит время. Кроме того, количественное определение ооцитов происходит относительно быстро, в зависимости от размера яичника и расположения ооцитов.