マウスの発達中の卵巣保護区の定量的3D分析のための全卵巣免疫蛍光、クリアリング、および多光子顕微鏡

ほとんどの哺乳類の雌は、卵巣予備(OR)を構成する原始卵胞内に貯蔵された有限数の減数的に停止した卵母細胞で生まれ^ます1,2。ORは、女性の全体的な生殖寿命と健康状態を決定します³.ORは通常、加齢とともにサイズが減少し、特定の遺伝毒性物質(放射線/化学療法)および環境ストレス(栄養失調)への曝露により早期に枯渇し、不妊症につながる可能性がある^4,5,6。特発性女性不妊症は、ORから発達する卵の遺伝的および生理学的品質に起因することが多く、あまり理解されていない^7,8。雌卵胞の授乳は出生によって大部分があらかじめ決められているため、ORの確立と維持に関与する調節メカニズムを理解することが不可欠です。

マウスにおいて、OR形成は、胚日(E)7.5²の周りの始原生殖細胞(PGC)の仕様から始まる。PGCは生殖器の隆起に移動し、そこで約E10.5⁹が常駐します。以下の広範な増殖は、不完全なサイトカイン作用で起こり、その結果、嚢胞の形成が起こり、それは開発の後半で分解される^10,11。約E12.5で、性腺の性別が決定され、卵巣におけるPGC増殖が停止する。女性では、PGC(現在は卵母細胞)は、約E13.5^12,13で減数分裂前期I(MPI)^に入る。卵母細胞は、拡張MPIを介して進行し、出生時の周りの指示段階で逮捕する。生後最初の1週間の間に、逮捕された各卵母細胞は顆粒膜細胞に囲まれ、それによって原始卵胞を形成する。

女性のORにおける始原卵胞の数は、アポトーシス、オートファジー、または壊死によるMPI停止の前および最中に起こる卵母細胞排除の波を生き残った卵母細胞の数に依存する^14,15。第1波は胎児の発育中に発生し、FOAとして知られています。FOAは、雌(哺乳類および非哺乳類)における進化的に保存されたプロセスであり、それによって、雌種に応じて卵母細胞の推定50〜80%が排除される¹⁶、^17、18、19。マウスでは、FOAはE15.5からE18.5の間に発生し、レトロトランスポゾンLINE-1配列の再活性化および発現が卵母細胞死を引き起こすことに起因している^20,21。卵母細胞除去の第2波は、修復されていないDNA二本鎖切断(DSB)^22,23などの減数分裂欠損を有する卵母細胞を排除する減数分裂チェックポイントを介して起こる。卵母細胞排除の次の波は、嚢胞の分解中に起こり、それぞれが単一の卵母細胞¹⁰、¹¹、^24、25を含む原始卵胞の形成中に最高潮に達する。

マウスでは、始原卵胞予備は思春期までに大部分が確立され、その後、始原卵胞が定期的な生殖サイクル中に成長のために活性化されるにつれて減少する。ORサイズは、個々の女性間およびマウスの異なる遺伝的系統間で異なる。しかし、ORサイズの遺伝的調節はよく理解されていない^26,27,28,29。OR調節の遺伝学的研究は、出生前および出生後の発達中の卵母細胞除去の波を研究するための標準化されたプロトコルの欠如によって妨げられている。いくつかの卵母細胞定量化方法論がマウスにおいて開発されており、最も一般的で広く使用されているのは、組織学的切片^30、31の組織形態学的評価である。この技術では、卵母細胞は、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)および過ヨウ素酸シッフ(PAS)または蛍光マーカーなどの組織学的染色を有する連続切片上で同定される。この技術は、切片の厚さ、卵巣全体のすべての切片の効率的な回収、および個々の実験室の計数スキームを含む、すべての条件が一定であれば信頼性が高い。しかし、異なる研究所によって報告された数字はしばしば大きく異なるため、容易に比較することはできません。

さらに、遺伝的差異を考えると、異なるマウス系統の使用も卵母細胞数に影響を及ぼし得る。組織形態評価のために追加の計算アプローチが開発されており、フラクショメータアプローチを用いた卵母細胞の自動検出、計算アルゴリズムを用いた自動計数、および同じ卵母細胞の複数の計数を防止するための組織学的画像の3D再構成³¹、³²、33、^34、35、36が含まれる。.これらの改善が組織形態評価に追加されても、この技術は、特に大規模でハイスループットな研究では、比較的労働集約的である。収集されたデータは、計数スキーム、コンピュータアルゴリズム、および使用されるソフトウェアの違いにより、研究間で再現性および比較できない場合があります。

近年、新しい中分解能多光子および光シート顕微鏡法および光学組織透明化法の開発によって加速され、無傷の卵巣の3Dモデリングおよび解析技術は、卵母細胞数を効率的に定量し、タンパク質の局在およびダイナミクスを研究するための選択方法になりつつある^37,38。これらの3D方法は、組織および器官がよりよく保存され、無傷で維持されるため、組織学的方法と比較して典型的に有利である。さらに、3D解析とモデリングは、2D解析では見逃される可能性のある臓器内の細胞ニッチまたは下部構造内および細胞ニッチまたは下部構造間の機能および相互作用に関する追加の洞察を提供します。

臓器全体の3D解析では、組織の歪みや損傷なしに、卵巣などの個々の臓器の固定、免疫染色、および光学的クリアリングプロトコルを最適化する必要があります。高解像度顕微鏡では、イメージングのためのサンプルマウントの追加最適化が必要であり、利用可能なイメージングプラットフォームに依存する場合があります。最後に、無傷の卵巣全体をイメージングすると、その後の計算分析のために大量のデータが生成されます。したがって、比較研究のために、および発生段階にわたって卵母細胞を計数するための標準化された3D方法を開発する必要がある。

このプロトコルは、標準的な免疫染色および以前に報告されたクリアリングプロトコルを使用し、シンプルでユーザーフレンドリーでハイスループットなアプローチ^{に焦点を当てています38,39,40,41}。このプロトコルは、出生後28日目(P28)までの多数の出生前および出生後の卵巣、および異なるマウス遺伝的背景からの様々なサイズの卵巣を分析するように最適化されている。免疫染色ステップは、すべてのステージで類似している。しかし、開嚢プロトコルは、そのサイズが大きいため、思春期卵巣では異なり、ScaleS4(0)およびCUBICは、それぞれ^40,41の小卵巣および大型卵巣の場合である。さらに、全身灌流は、血球からの自己蛍光を防ぐために、固定前にP28マウスにおいて行われる。画像を取得するためのライトシート顕微鏡の代替として、Leica DIVE/4Tuneプラットフォーム上に多光子顕微鏡が構築され、このプロトコルにはさまざまな分析ツールを備えたIMARISの3D視覚化および分析ソフトウェアが選択されました。このプロトコルは従うのが簡単で、実践的ではないため、時間を節約できます。さらに、卵母細胞の定量化は、卵巣のサイズおよび卵母細胞の配置に依存して、比較的迅速である。