Immunofluorescence, clairance et microscopie multiphotonique des ovaires entiers pour l’analyse 3D quantitative de la réserve ovarienne en développement chez la souris

La plupart des femelles mammifères naissent avec un nombre fini d’ovocytes arrêtés méiotiquement stockés dans des follicules primordiaux, constituant la réserve ovarienne (RC)^1,2. La RO détermine la durée de vie reproductive globale et la santé des femmes³. La salle d’opération diminue normalement en taille avec le vieillissement et peut être épuisée prématurément lors de l’exposition à certains agents génotoxiques (radiothérapie / chimiothérapie) et à des stress environnementaux (malnutrition), conduisant à l’infertilité ^4,5,6. L’infertilité féminine idiopathique peut souvent être attribuée à la qualité génétique et physiologique des ovules qui se développent à partir de la salle d’opération et reste mal comprise ^7,8. Étant donné que la dotation en follicules féminins est largement prédéterminée par la naissance, il est essentiel de comprendre les mécanismes de régulation impliqués dans l’établissement et l’entretien de la salle d’opération.

Chez la souris, la formation de RO commence par la spécification des cellules germinales primordiales (PGC) autour du jour embryonnaire (E) 7,5². Les PGC migrent vers les crêtes génitales, où ils résideront vers E10,5⁹. La prolifération étendue suivante se produit avec une cytocinèse incomplète entraînant la formation de kystes qui seront décomposés plus tard dans le développement^10,11. À environ E12,5, le sexe gonadique est déterminé et la prolifération de la PGC s’arrête dans les ovaires. Chez les femelles, les PGC, maintenant des ovocytes, entrent dans la prophase méiotique I (MPI) à environ E13,5^12,13. Les ovocytes progressent grâce à une MPI prolongée et à un arrêt au stade du dictyat au moment de la naissance. Au cours de la première semaine après la naissance, chaque ovocyte arrêté est entouré de cellules de granulosa, formant ainsi un follicule primordial.

Le nombre de follicules primordiaux dans la salle d’opération d’une femme dépend du nombre d’ovocytes qui ont survécu aux vagues d’élimination des ovocytes qui se produisent avant et pendant l’arrêt de la MPI par apoptose, autophagie ou nécrose^14,15. La première vague se produit pendant le développement du fœtus et est connue sous le nom de FOA. Le FOA est un processus conservé de manière évolutive chez les femelles (mammifères et non mammifères), par lequel environ 50 à 80% des ovocytes sont éliminés en fonction des espèces femelles 16,17,18,19. Chez la souris, le FOA se produit au cours de E15,5 à E18.5 et a été attribué à la réactivation et à l’expression de séquences de rétrotransposon LINE-1 provoquant la mort des ovocytes^20,21. La deuxième vague d’élimination des ovocytes se produit par un point de contrôle méiotique qui élimine les ovocytes présentant des défauts méiotiques tels que les cassures double brin d’ADN non réparées (DSB)^22,23. La prochaine vague d’élimination des ovocytes se produit lors de la dégradation des kystes, culminant lors de la formation de follicules primordiaux, dont chacun contient un seul ovocyte ^10,11,24,25.

Chez la souris, la réserve de follicules primordiaux est largement établie par la puberté, après quoi elle diminue à mesure que les follicules primordiaux sont activés pour la croissance au cours des cycles de reproduction réguliers. La taille de la salle d’opération varie d’une femme à l’autre et de différentes souches génétiques de souris; pourtant, la régulation génétique de la taille des salles d’opération n’est pas bien comprise ^26,27,28,29. Les études génétiques de la régulation de la RO sont entravées par l’absence de protocoles standardisés pour étudier les vagues d’élimination des ovocytes au cours du développement prénatal et postnatal. Plusieurs méthodes de quantification des ovocytes ont été développées chez la souris, la plus courante et la plus largement utilisée étant l’évaluation histomorphométrique des sections^{histologiques 30,31}. Dans cette technique, les ovocytes sont identifiés sur des coupes en série avec des taches histologiques, telles que l’hématoxyline et l’éosine (H & E) et l’acide-Schiff périodique (PAS) ou des marqueurs fluorescents. Cette technique est fiable si toutes les conditions restent constantes, y compris l’épaisseur de la section, la récupération efficace de toutes les sections dans l’ovaire et les schémas de comptage des laboratoires individuels. Cependant, les chiffres rapportés par les différents laboratoires diffèrent souvent de manière significative et ne sont donc pas facilement comparables.

De plus, compte tenu des différences génétiques, l’utilisation de différentes souches de souris peut également influencer le nombre d’ovocytes. D’autres approches computationnelles ont été développées pour l’évaluation histomorphométrique et comprennent la détection automatisée des ovocytes à l’aide de l’approche du fractionneur, le comptage automatique à l’aide d’algorithmes informatiques et la reconstruction 3D d’images histologiques pour éviter le comptage multiple du même ovocyte ^{31,32,33,34,35,36} . Même avec ces améliorations ajoutées à l’évaluation histomorphométrique, la technique est relativement exigeante en main-d’œuvre, en particulier pour les études à grande échelle et à haut débit. Les données recueillies peuvent ne pas être reproductibles et comparables entre les études en raison des différences dans les schémas de comptage, les algorithmes informatiques et les logiciels utilisés.

Récemment, accélérées par le développement de nouvelles méthodes de microscopie multiphotonique et de feuille de lumière à moyenne résolution et de nettoyage optique des tissus, les techniques de modélisation et d’analyse 3D pour les ovaires intacts deviennent la méthode de choix pour quantifier efficacement le nombre d’ovocytes et étudier la localisation et la dynamique des protéines^37,38. Ces méthodes 3D sont généralement avantageuses par rapport aux méthodes histologiques car les tissus et les organes sont mieux conservés et conservés intacts. De plus, l’analyse et la modélisation 3D fournissent des informations supplémentaires sur la fonction et les interactions au sein et entre les niches ou sous-structures cellulaires de l’organe qui peuvent être manquées dans l’analyse 2D.

L’analyse 3D d’organes entiers nécessite une optimisation des protocoles de fixation, d’immunocoloration et de nettoyage optique pour des organes individuels, tels que les ovaires, sans distorsion ou dommage tissulaire. Une optimisation supplémentaire du montage de l’échantillon pour l’imagerie est nécessaire pour la microscopie à haute résolution et peut dépendre de la plate-forme d’imagerie disponible. Enfin, l’imagerie de l’ensemble de l’ovaire intact génère une grande quantité de données pour les analyses informatiques ultérieures. Par conséquent, il est nécessaire de développer des méthodes 3D standardisées pour compter les ovocytes pour les études comparatives et à tous les stades de développement.

Ce protocole utilise des protocoles d’immunocoloration standard et de compensation précédemment rapportés, en se concentrant sur une approche simple, conviviale et à haut débit 38,39,40,41. Le protocole est optimisé pour analyser un grand nombre d’ovaires prénataux et postnatals jusqu’au jour postnatal 28 (P28) et différentes tailles d’ovaires de différents milieux génétiques de souris. Les étapes d’immunocoloration sont similaires pour toutes les étapes; cependant, les protocoles de clairance diffèrent pour les ovaires pubertaires en raison de leur plus grande taille, ScaleS4(0) et CUBIC pour les petits et grands ovaires, respectivement^40,41. En outre, la perfusion du corps entier est effectuée chez les souris P28 avant la fixation pour prévenir l’autofluorescence des cellules sanguines. Un microscope multiphoton a été construit sur la plate-forme Leica DIVE/4Tune comme alternative à la microscopie à feuille de lumière pour acquérir des images, et le logiciel de visualisation et d’analyse 3D IMARIS avec divers outils analytiques a été choisi pour ce protocole. Ce protocole est simple à suivre et moins pratique, ce qui permet de gagner du temps. De plus, la quantification des ovocytes est relativement rapide, en fonction de la taille de l’ovaire et de la disposition des ovocytes.