Imunofluorescência total do ovário, compensação e microscopia multifotínica para análise quantitativa 3D da reserva ovariana em desenvolvimento em mouse

A maioria das fêmeas de mamíferos nasce com um número finito de oócitos presos por meioticamente armazenados dentro de folículos primordiais, constituindo a reserva ovariana (OR)^1,2. O BO determina a vida reprodutiva geral feminina e a saúde³. O OR normalmente diminui de tamanho com o envelhecimento e pode ser prematuramente esgotado após a exposição a certos agentes genotoxicos (radiação/quimioterapia) e estresses ambientais (desnutrição), levando à infertilidade ^4,5,6. A infertilidade feminina idiopática pode muitas vezes ser atribuída à qualidade genética e fisiológica dos ovos que se desenvolvem a partir do BO e permanece mal compreendida ^7,8. Como a dotação do folículo feminino é em grande parte predeterminada pelo nascimento, é essencial compreender os mecanismos regulatórios envolvidos no estabelecimento e manutenção do OR.

Em camundongos, a formação de OR começa com a especificação de células germinativas primordiais (PGCs) em torno do dia embrionário (E) 7,5². Os PGCs migram para os cumes genitais, onde residirão por aproximadamente E10,5⁹. A proliferação extensiva a seguir ocorre com citocinas incompletas resultando na formação de cistos que serão quebrados mais tarde no desenvolvimento^10,11. Aproximadamente E12,5, o sexo gonadal é determinado, e a proliferação de PGC para em ovários. No feminino, os PGCs, agora oócitos, entram em prophase I (MPI) em aproximadamente E13,5^12,13. Os ocitos progridem através de IPM estendido e prisão na fase de dictyate na época do nascimento. Durante a primeira semana após o nascimento, cada oócito preso é cercado por células de granulosa, formando assim um folículo primordial.

O número de folículos primordiais no OR de uma fêmea depende de quantas oócitos sobreviveram às ondas de eliminação de oócitos que ocorrem antes e durante a prisão do IMP por apoptose, autofagia ou necrose^14,15. A primeira onda ocorre durante o desenvolvimento fetal e é conhecida como FOA. O FOA é um processo evolutivamente conservado em fêmeas (mamíferos e não-mamíferos), pelo qual cerca de 50-80% dos oócitos são eliminados dependendo da espécie feminina 16,17,18,19. Em camundongos, o FOA ocorre durante o E15.5 ao E18.5 e tem sido atribuído à reativação e expressão de sequências retrotransposon LINE-1 causando morte oócida^20,21. A segunda onda de eliminação de oócitos ocorre através de um ponto de verificação meiotic que elimina oócitos com defeitos meioticos, como quebras de duplo fio de DNA não reparadas (DSBs)^22,23. A próxima onda de eliminação de oócito ocorre durante a quebra do cisto, culminando durante a formação de folículos primordiais, cada um dos quais contém um único oócito 10,11,24,25.

Em camundongos, a reserva primordial do folículo é em grande parte estabelecida pela puberdade, após a qual diminui à medida que folículos primordiais são ativados para o crescimento durante ciclos reprodutivos regulares. O tamanho do OR varia entre as mulheres individuais e entre diferentes cepas genéticas de camundongos; ainda assim, a regulação genética do tamanho do OR não é bem compreendida 26,27,28,29. Estudos genéticos de regulação de OR são dificultados pela falta de protocolos padronizados para estudar as ondas de eliminação de oócitos durante o desenvolvimento pré-natal e pós-natal. Várias metodologias de quantificação oócito foram desenvolvidas em camundongos, sendo a mais comum e amplamente utilizada a avaliação histomorfométrica das seções histológicas^30,31. Nesta técnica, os oócitos são identificados em seções seriais com manchas histológicas, como hematoxilina e eosina (H&E) e ácido periódico-Schiff (PAS) ou marcadores fluorescentes. Esta técnica é confiável se todas as condições permanecerem constantes, incluindo espessura de seção, recuperação eficiente de todas as seções ao longo do ovário e os esquemas de contagem de laboratórios individuais. No entanto, os números relatados por diferentes laboratórios muitas vezes diferem significativamente e, portanto, não são facilmente comparáveis.

Além disso, dadas as diferenças genéticas, o uso de diferentes cepas de camundongos também pode influenciar a contagem de oócitos. Abordagens computacionais adicionais foram desenvolvidas para avaliação histomorfométrica e incluem a detecção automatizada de oócitos usando a abordagem fracionado, contagem automática usando algoritmos computacionais e reconstrução 3D de imagens histológicas para evitar múltiplas contagens do mesmo oócito 31,32,33,34, ^35,36 . Mesmo com essas melhorias adicionadas à avaliação histomorfométrica, a técnica é relativamente intensiva em mão-de-obra, particularmente para estudos de grande escala e de alto rendimento. Os dados coletados podem não ser reprodutíveis e comparáveis entre estudos devido a diferenças nos esquemas de contagem, algoritmos de computador e software utilizado.

Recentemente, acelerado pelo desenvolvimento de novos métodos de microscopia multifotônio de média resolução e folha de luz e métodos de limpeza de tecidos ópticos, técnicas de modelagem e análise 3D para ovários intactos estão se tornando o método de escolha para quantificar eficientemente os números de oócitos e estudar a localização e dinâmica de proteínas^37,38. Esses métodos 3D são tipicamente vantajosos em comparação com métodos histológicos, pois tecidos e órgãos são melhor preservados e mantidos intactos. Além disso, a análise e modelagem 3D fornecem insights adicionais sobre a função e interações dentro e entre nichos celulares ou subestruturas dentro do órgão que podem ser perdidas na análise 2D.

A análise 3D de órgãos inteiros requer otimização de protocolos de fixação, imunostação e limpeza óptica para órgãos individuais, como ovários, sem distorção tecidual ou danos. Uma otimização adicional da montagem da amostra para imagens é necessária para microscopia de alta resolução e pode depender da plataforma de imagem disponível. Finalmente, a imagem de todo o ovário intacto gera uma grande quantidade de dados para análises computacionais subsequentes. Portanto, é necessário desenvolver métodos 3D padronizados para contagem de oócitos para estudos comparativos e em estágios de desenvolvimento.

Este protocolo usa protocolos de limpeza padrão e previamente relatados, com foco em uma abordagem simples, fácil de usar e de alto rendimento 38,39,40,41. O protocolo é otimizado para analisar um grande número de ovários pré-natal e pós-natal até o pós-natal 28 (P28) e tamanhos variados de ovários de diferentes origens genéticas de camundongos. As etapas de imunossuagem são semelhantes para todas as etapas; no entanto, os protocolos de compensação diferem para ovários pubertal devido ao seu tamanho maior, ScaleS4(0) e CUBIC para ovários pequenos e grandes, respectivamente^40,41. Além disso, a perfusão do corpo inteiro é realizada em camundongos P28 antes da fixação para evitar a autofluorescência das células sanguíneas. Um microscópio multifotográfico foi construído sobre a plataforma Leica DIVE/4Tune como alternativa à microscopia de folha de luz para adquirir imagens, e foi escolhido um software de Visualização e Análise 3D IMARIS com várias ferramentas analíticas para este protocolo. Este protocolo é simples de seguir e menos prático, portanto economizando tempo. Além disso, a quantificação do oócito é relativamente rápida, dependendo do tamanho do ovário e arranjo de oócitos.