Nous présentons une technique pour stabiliser rapidement les complexes translationnels (biosynthèse des protéines) avec réticulation du formaldéhyde dans les cellules de levures et de mammifères vivantes. L’approche permet de disséquer les intermédiaires transitoires et les interactions dynamiques ARN:protéine. Les complexes réticulés peuvent être utilisés dans de multiples applications en aval telles que les méthodes de profilage basées sur le séquençage en profondeur, la microscopie et la spectrométrie de masse.
Les réponses rapides impliquant une redistribution rapide de l’ARN messager (m) et des altérations de la traduction de l’ARNm sont pertinentes pour les ajustements homéostatiques en cours des cellules. Ces ajustements sont essentiels à la survie des cellules eucaryotes et au « contrôle des dommages » lors de la fluctuation des niveaux de nutriments et de salinité, de la température et de divers stress chimiques et radiologiques. En raison de la nature très dynamique des réponses au niveau de l’ARN et de l’instabilité de nombreux intermédiaires ARN:ARN et ARN:protéine, l’obtention d’un instantané significatif de l’état de l’ARN cytoplasmique n’est possible qu’avec un nombre limité de méthodes. Les expériences de profilage de ribosomes à l’échelle du transcriptome et basées sur l’ARN sont parmi les sources de données les plus informatives pour le contrôle de la traduction. Cependant, l’absence d’une stabilisation intermédiaire uniforme de l’ARN et de l’ARN:protéine peut entraîner différents biais, en particulier dans les voies de réponse cellulaire au rythme rapide. Dans cet article, nous fournissons un protocole détaillé de fixation rapide applicable aux cellules eucaryotes de perméabilité différente, pour aider à la stabilisation intermédiaire de l’ARN et de l’ARN: protéine. Nous fournissons également des exemples d’isolement des complexes ARN:protéine stabilisés en fonction de leur co-sédimentation avec des fractions ribosomiques et poly(ribo)somales. Le matériau stabilisé séparé peut ensuite être utilisé dans le cadre d’expériences de type profilage de ribosomes, telles que l’approche de séquençage de profils complexes de traduction (TCP-seq) et ses dérivés. La polyvalence des méthodes de style TCP-seq a maintenant été démontrée par les applications dans une variété d’organismes et de types de cellules. Les complexes stabilisés peuvent également être purifiés par affinité et imagés à l’aide de la microscopie électronique, séparés en différentes fractions poly(ribo)somales et soumis au séquençage de l’ARN, en raison de la facilité de l’inversion de la réticulation. Par conséquent, les méthodes basées sur le refroidissement instantané et la fixation du formaldéhyde, suivies de l’enrichissement à base de sédimentation ou d’un autre type d’enrichissement du complexe ARN:protéine, peuvent être particulièrement intéressantes pour étudier les détails plus fins de la dynamique rapide du complexe ARN:protéine dans les cellules vivantes.
Les organismes vivants sont soumis à des changements intra- et extracellulaires dynamiques tout au long de leur vie, qui nécessitent des réponses rapides pour maintenir l’homéostasie et assurer leur survie. Pour permettre l’adaptation environnementale, les cellules eucaryotes ajustent leur métabolisme via le contrôle de l’expression des gènes. Le contrôle de l’expression génique peut être exercé pendant la transcription et/ou la traduction; avec des réponses translationnelles se produisant généralement plus rapidement1,2,3,4. Par exemple, les changements translationnels surviennent généralement dans les 1 à 30 minutes suivant l’apparition du stress, tandis que les altérations au niveau de la transcription suivent des heures aprèsl’expositionau stress3,4,5. Les altérations de la production de traduction sont obtenues plus rapidement en raison de la disponibilité persistante de molécules d’ARN messager (m) dans le cytoplasme. Inversement, au niveau de la transcription, de nouvelles molécules d’ARNm doivent être synthétisées, et chez les eucaryotes, traitées et exportées à partir du noyau, produisant des retards importants dans le temps de réponse2,4,6,7,8.
La réponse translationnelle aiguë au stress est généralement caractérisée par une diminution globale de la production de traduction, avec la régulation sélective à la hausse des protéines nécessaires à la survie cellulaire1,3,4,9. La diminution de la production de protéines est considérée comme cruciale en raison de la dépense énergétique élevée du processus3,7. Pour faciliter l’inhibition sélective et la régulation à la hausse, les réponses translationnelles sont servies par une gamme de mécanismes de régulation complexes. La régulation peut être exercée à travers toutes les phases de la traduction : initiation, allongement, fin de la biosynthèse polypeptidique et recyclage ribosomique10,11,12,13, mais se manifeste le plus fortement à la phase d’initiation5,7,9,10,13. Au cours de l’initiation, la petite sous-unité ribosomique (SSU), assistée par des facteurs d’initiation eucaryotes (eIF), se lie et scanne la région non traduite (UTR) de 5′ de l’ARNm jusqu’à ce qu’un codon de départ soit reconnu2,5,6,8,11,12,13. Les mécanismes de réglementation ciblent souvent les eIF affectant la reconnaissance des joints, la numérisation et le démarrage. Par exemple, le facteur d’initiation eIF2, un facteur de traduction essentiel qui aide au recrutement d’un initiateur Met-ARNtiMet à la SSU, est souvent ciblé chez les eucaryotes dans des conditions de stress4,6,11. Chez la levure, la phosphorylation de ce facteur peut être induite sous privation de nutriments et stress osmotique1,4,11,14,15, et dans les cellules de mammifères, la famine en acides aminés, le stress du réticulum endoplasmique (RE), le stress UV, l’infection virale et les niveaux d’oxygène altérés peuvent déclencher cette réponse8,9,11. La régulation rapide de la traduction spécifique de l’ARNm est évidente dans la réponse des cellules de mammifères à l’hypoxie, qui présente une inhibition globale de la traduction rapide et une régulation sélective à la hausse de la biosynthèse des facteurs inductibles par l’hypoxie (HIF). Les HIF sont des facteurs de transcription, qui provoquent ensuite une reprogrammation cellulaire à plus long terme au niveau de la transcription de l’ADN.8,9,16. Des réponses similaires ont été observées chez les levures soumises à un stress thermique, avec une expression translationnelle rapide des protéines de choc thermique (HSP) suivie de réponses retardées au niveau de la transcription17,18. En plus de la privation de nutriments et du choc thermique, les réponses translationnelles chez la levure ont été étudiées sous différents modes d’oxygène.8,19salinité5, phosphate, soufre20,21 et l’azote22,23 Niveaux. Cette recherche a des implications généralisées pour les utilisations industrielles de la levure, telles que la cuisson et la fermentation24,25. Les réponses translationnelles peuvent également contribuer à mieux comprendre des maladies telles que les troubles neurodégénératifs et les maladies cardiaques, qui se caractérisent par des stress intracellulaires tels que le stress oxydatif. Dans l’ensemble, les réponses translationnelles font partie intégrante du contrôle de l’expression génique et facilitent l’adaptation rapide à un large éventail de conditions de stress chez les organismes eucaryotes.
Afin d’étudier les réponses translationnelles, il est nécessaire de disposer de méthodes qui fournissent des instantanés du paysage de la traduction les moins déformés. Le profilage des polysomes est une approche classique utilisée dans l’étude de la traduction à travers l’ARNm, impliquant la séparation des fractions poly(ribo)somales de l’ARNm par ultracentrifugation par gradients de saccharose26,27. L’approche peut être utilisée pour explorer les niveaux de traduction pour les ARNm individuels (avec les méthodes de détection telles que la transcription inverse et la réaction en chaîne par polymérase, RT-PCR26),ou globalement en conjonction avec des techniques à haut débit (microréseau ou ARN-seq28,29). Une approche plus évoluée est le profilage des ribosomes, qui permet d’étudier les positions des ribosomes allongés le long d’une molécule d’ARNm à l’échelle du génome, ainsi que l’inférence de l’efficacité de la traduction à travers le transcriptome et l’utilisation des sites de départ principaux et alternatifs30,31. Le profilage des ribosomes implique l’isolement et le séquençage de fragments d’ARNm protégés par la présence ribosomique sur eux. Le profilage des ribosomes a fourni des informations considérables sur la dynamique de la traduction dans un certain nombre de conditions, y compris le stress hypoxique, le choc thermique et le stress oxydatif31,32. La technique a été adaptée à plusieurs types de matériaux sources, y compris les cellules de levure et de mammifères.
Alors que le profilage des polysomes et des ribosomes a été fondamental dans l’extension des capacités de la recherche en traduction, le processus de traduction comprend divers intermédiaires et complexes translationnels qui sont difficiles à capturer avec ces méthodes11,13. Une limitation supplémentaire provient du manque de capacité à étudier les types de réponse rapide, car les complexes translationnels sont soit stabilisés in vivo par l’ajout d’inhibiteurs de traduction spécifiques (antibiotiques), conduisant à certains artefacts de distribution des ribosomes, soit ex vivo lors de la lyse cellulaire spécifiquement (antibiotiques) ou de manière non spécifique (ions sel ou magnésium élevés), conduisant à la privation des intermédiaires à vie plus courte ou moins stables33, 34,35.
Le formaldéhyde est largement utilisé pour réticuler les acides nucléiques et les protéines, comme dans les études d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et d’immunoprécipitation réticulative (CLIP). Sa petite taille et son excellente perméabilité cellulaire permettent une action in vivo rapide36. Sur la base de la réticulation rapide du formaldéhyde, l’approche de profilage des ribosomes a été étendue avec le séquençage de profil complexe de traduction (TCP-seq)10,36,37,38,39,40. TCP-seq, d’abord développé en levure, permet la capture de tous les intermédiaires de traduction, y compris les complexes SSU à balayage ou post-terminaison et les configurations ribosomiquesmultiples37,38,41,42. La méthode a été utilisée dans plusieurs études10,38,39,41,42, dont certaines utilisent une approche combinatoire des inhibiteurs de traduction et de la réticulation du formaldéhyde pour faciliter l’arrêt de la traduction. Une autre version modifiée de la technique, tcp-seq39sélectif, a récemment été utilisée pour inclure l’immunopurification des complexes réticulés, élargissant ainsi la portée des applications TCP-seq. La nature rapide, efficace et réversible de la réticulation du formaldéhyde rend ces approches adaptées à l’étude des interactions complexes transitoires ARNm:traduction, en particulier dans le contexte de voies de réponse très dynamiques au niveau de la traduction.
Nous détaillons ici les processus de réticulation in vivo du formaldéhyde dans le but d’une stabilisation et d’un isolement complexes de traduction complète. Nous fournissons des protocoles distincts nuancés pour les cellules de levure et de mammifère(Figure 1). Nous décrivons également des exemples d’utilisation ultérieure du matériau stabilisé par réticulation(figure 1),par exemple pour la détection du facteur protéique co-purifié à l’aide de l’immunobuvardage (Western-blotting), de la purification immuno-assistée (ou « immunoprécipitation »; IP) et l’enrichissement de complexes translationnels contenant des facteurs d’intérêt spécifiques, la microscopie électronique et le séquençage de l’ARN.
Figure 1: Schéma illustrant une vue d’ensemble de la configuration expérimentale typique. Les principales étapes de la stabilisation in vivo du formaldéhyde des complexes translationnels sont représentées sous la forme d’un organigramme, complété par des informations sur les principaux instruments nécessaires. Les applications potentielles en aval du matériau réticulé sont décrites, y compris des exemples qui ont été utilisés avec succès mais qui ne sont pas directement couverts par ce protocole, tels que la purification de l’ARN par billes SPRI, le séquençage de l’ARN et la spectrométrie de masse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
La fixation du formaldéhyde est une méthode pratique et populaire pour obtenir une réticulation rapide in vivo des biomolécules10,36,45,46,47,48. Par rapport aux autres cibles potentielles de biomolécules, la capture réussie de complexes translationnels nécessite une fixation immédiate lors du refroidissement instantané des cellules ou d’un autre matériau. Sans la stabilisation non retardée, il est possible que différents processus liés à la traduction se poursuivent, déplaçant la distribution complexe loin de l’état in vivo non perturbé49. Par rapport aux autres méthodes d’arrêt translationnel et de stabilisation du complexe ribosomique, la rapidité de l’action du formaldéhyde à travers les membranes cellulaires et la nature aveugle des réticulations promettent la préservation de la diversité maximale des intermédiaires complexes de traduction plus proches de leurs états distribués nativement50.
L’approche présentée ici a été établie et optimisée dans les cellules de levure et de mammifère, et des méthodes ont maintenant été dérivées par d’autres groupes pour une utilisation dans du matériel biologique plus diversifié, comme chez les vertébrés entiers (par exemple, les embryons de poisson zèbre)10,38,39,49,51,52 . Bien que ces travaux rassurent collectivement la polyvalence et la large applicabilité de l’approche, la réticulation rapide du formaldéhyde des complexes translationnels peut être considérée comme quelque peu difficile à transposer à de nouveaux types de matériel biologique en raison de la nécessité d’optimisations et d’ajustements.
Une exigence primordiale pour le succès de la méthode est la ré-optimisation de la concentration du formaldéhyde et la technique de collecte et de perturbation cellulaire. Les cellules de levure moins perméables, petites et rondes nécessitent une concentration de formaldéhyde beaucoup plus élevée (au moins 10 fois) et une perturbation physique des cellules fixes. En revanche, les cellules de mammifères adhérentes grandes et aplaties en culture peuvent être facilement surfixées et nécessitent une manipulation douce lors de la fixation, tandis que l’extraction des complexes fixes peut être effectuée chimiquement avec perturbation de la membrane à l’aide de détergents. La sous-réticulation peut permettre à des intermédiaires moins stables ou à plus courte durée de vie de se dissocier ou de s’infiltrer dans un état ultérieur. La surréticulation peut affecter négativement la capacité d’isoler et d’étudier les fractions ribosomiques et peut créer des biais sélectifs tels que l’épuisement plus profond des complexes lourds. Dans notre observation, même des altérations mineures, telles que le type de cellules humaines adhérentes utilisées, peuvent affecter le rendement des complexes réticulés récupérés et peuvent nécessiter une réoptimisation du schéma de réticulation. Nous pouvons également prévoir que les cellules ayant des propriétés de perméabilité sensiblement différentes, telles que les cellules végétales, nécessiteront une optimisation supplémentaire étendue des conditions de fixation52. Pourtant, il est difficile d’imaginer un type de matériel biologique qui serait totalement incompatible avec l’approche.
Une considération pertinente pour le protocole de fixation des mammifères est la densité et la quantité de matériel cellulaire utilisé comme intrant. Il est recommandé de faire croître les cellules en continu sans réensemencement ou autres perturbations pendant au moins 2 jours pour éviter les influences externes sur la dynamique de la traduction cellulaire. Applicable pour la plupart des types de cellules, mais pour la majorité des cellules adhérentes, des niveaux de confluence ne dépassant pas 70% garantiront l’absence d’effets majeurs d’inhibition de contact pouvant affecter négativement et de manière imprévisible les taux de traduction.
Une autre caractéristique intéressante, et potentiellement particulièrement pratique, de la fixation du formaldéhyde découlant de sa réactivité aveugle est l’effet de stabilisation sur les complexes translationnels dans les systèmes de taxonomie mixte. Les complexes bactériens, et plus encore translationnels de mitochondries, de chloroplastes et de différents parasites intracellulaires, ont été notoirement difficiles à cibler avec des inhibiteurs de traduction spécifiques. En revanche, dans les données TCP-seq, les empreintes mappées au mitotranscriptome sont facilement observables dans les données38,39,50. Un développement ultérieur intéressant pourrait être l’utilisation de l’approche pour étudier la traduction dans des microcommunautés entières, telles que dans des échantillons de sol, d’eau ou d’intestin, où un arrêt translationnel rapide fiable et une stabilisation complexe avec tout autre moyen seraient problématiques.
Il convient également de mentionner que pour les matériaux les plus compliqués (tels que les tissus durs et / ou volumineux), rien n’empêche l’utilisation de la stabilisation du formaldéhyde immédiatement après la perturbation cellulaire et l’homogénéisation du matériau. Cette approche est déjà fréquemment utilisée pour éliminer le délai d’entrée cellulaire lors de la stabilisation de complexes translationnels avec des inhibiteurs spécifiques de petites molécules33,53,54,55. Étant donné que la fixation du formaldéhyde a été traditionnellement utilisée avec d’excellents résultats pour la stabilisation d’échantillons ex vivo / in vitro dans des applications telles que la microscopie électronique45,56 , 57,58, nous pouvons nous attendre à des effets encore moins négatifs dans ce cas, en particulier ceux associés à la mauvaise extraction des complexes translationnels des cellules complètement fixées.
Nos résultats confirment la facilité d’utilisation de la fixation rapide du formaldéhyde pour stabiliser les complexes hautement transitoires, tels que ceux qui incluent eIF4A. Il est à noter que, contrairement aux mammifères, la levure eIF4A est beaucoup plus faiblement associée au complexe de liaison au capuchon eIF4F et, par conséquent, aux complexes translationnels en général. eIF4A est généralement perdu lors d’une purification étendue du matériel ribosomique dans la levure29,59,60,61,62,63. Pourtant, dans le matériau de levure fixe in vivo,il est possible d’obtenir un enrichissement fiable d’eIF4A dans toutes les fractions de complexes translationnels où sa présence serait anticipée. Les données Sel-TCP-seq publiées précédemment ont démontré l’enrichissement d’eIF2 et d’eIF3 qui s’associent plus fortement aux ribosomes (mais ont également révélé un assemblage transitoire de complexe protéique co-translationnel)39. Ainsi, la méthode convient à la détection des constituants attachés plus forts et plus faibles des complexes translationnels.
Pour résumer, nous avons présenté une approche utile pour mieux comprendre principalement les changements qui se produisent à la phase d’initiation de la traduction et lorsque la distribution ribosomique sur l’ARNm est minimalement perturbée. Il est important de noter que l’approche convient à la stabilisation de composants relativement labiles et dynamiques de complexes translationnels, tels que eIF4A, et peut être largement utilisée sous réserve des optimisations nécessaires. Nous avons également fourni des preuves de l’utilité de la fixation du formaldéhyde dans les scénarios de changement dynamique rapide de la traduction, ouvrant des domaines d’investigation tels que les réponses cellulaires rapides aux changements environnementaux ou aux conditions de stress.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par une subvention du projet de découverte du Conseil australien de la recherche (DP180100111 à T.P. et N.E.S.), une subvention de chercheur du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (GNT1175388 à N.E.S.) et une bourse de recherche (APP1135928 à T.P.). Les auteurs reconnaissent les installations de Microscopy Australia au Centre for Advanced Microscopy de l’Université nationale australienne, une installation financée par l’Université et le gouvernement fédéral.
Yeast extract | Merck, Sigma-Aldrich | 70161 | |
Peptone | Merck, Sigma-Aldrich | 70178 | |
D-Glucose (Dextrose) | Merck, Sigma-Aldrich | 49139 | |
Adenine sulphate | Amresco | 0607-50G | |
Formaldehyde solution | Merck Sigma-Aldrich | F11635-500ML | ACS reagent, 37 wt. % in H2O, contains 10-15% Methanol as stabiliser (to prevent polymerisation) |
RNaseOUT™ Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Invitrogen™ byThermo Fischer Scientific | 10777019 | |
cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | COEDTAF-RO Roche by Merck | 11873580001 | |
Magnesium chloride solution | (Merck/Sigma-Aldrich) | M1028 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid solution | (Merck/Sigma-Aldrich) | E7889 | |
Ambion™ RNase I, cloned, 100 U/µL | Ambion | AM2294 | |
SUPERase•In™ RNase Inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
Acidic phenol:chlorophorm:isoamyl alcohol 125:24:1 (pH 4.0-5.0) | (Merck/Sigma-Aldrich) | P1944-100ML | |
Dynabeads™ Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) | 11033 | |
Sodium Acetate (3 M), pH 5.5 | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) | AM9740 | |
Glycogen (5 mg/ml) | Invitrogen™ by Thermo Fisher Scientific) | AM9510 | |
Ethyl alcohol, Pure | Merck; Sigma Aldrich | E7023 | |
Amersham™ Hybond® P Western blotting membranes, PVDF | Merck | GE10600023 | PVDF membrane for western blotting |
Bolt™ 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel | Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific | NW04120BOX | Protein gel |
4X Bolt™ LDS Sample Buffer | Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific | B0007 | LDS sample loading buffer |
Precision Plus Protein™ Kaleidoscope™ Prestained Protein Standards | BioRad | 1610375 | Protein ladder |
20X Bolt™ MES SDS Running Buffer | ThermoFischer Scientific | B0002 | PAGE runninjg buffer |
Intercept® (PBS) Blocking Buffer | LI-COR | 927-70001 | Odyssey Blcoking buffer (PBS) |
IRDye® 800CW Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 92632210 | |
IRDye® 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 92632211 | |
TAP Tag Polyclonal Antibody | Invitrogen™ by ThermoFischer Sientific | CAB1001 | |
Anti-beta Actin antibody | Abcam | ab8227 | |
Sucrose | (Merck/Sigma-Aldrich) | 84097 | BioUltra, for molecular biology, ≥99.5% (HPLC) |
DL-Dithiothreitol solution | (Merck/Sigma-Aldrich) | 43816 | BioUltra, for molecular biology, ~1 M in H2O |
Terumo Syringe 1CC/mL | Terumo Syringe | 878499 | |
Potassium chloride | (Merck/Sigma-Aldrich) | 60128 | |
HEPES | (Merck/Sigma-Aldrich) | H3375 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium – high glucose | Sigma Aldrich | D5796 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | 12003C | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline with Calcium and magnesium | Sigma-Aldrich | D8662 | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 | |
Tris hydrochloride | Merck/Sigma-Aldrich | 10812846001 | |
Sodium dodecyl sulfate | Merck/Sigma-Aldrich | 436143 | |
IGEPAL CA-630 | Merck/Sigma-Aldrich | I3021 | |
Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2111 | |
Stainless steel grinding jar | Retsch | 02.462.0059 | |
MM400 mixer mill | Retsch | 20.745.0001 | |
Gradient Fractionator | Brandel | BRN-BR-188 | |
Thermomixer R | Eppendorf | Z605271 | |
Nanodrop spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
0.5-ml microcentrifuge tubes with locking devices | Eppendorf Safe-Lock | 30121023 | |
Mini Gel Tank | (Thermo Fisher Scientific) | A25977 | PAGE running tank |
5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm | Beckman-Coulter | 344057 | |
13.2 mL, Certified Free Open-Top Thinwall Polypropylene, 14 x 89mm – 50Pk | Beckman-Coulter | 331372 | |
Amicon Ultra-0.5 ultrafiltration devices | Merck | UFC5030 | Ultracel-30 regenerated cellulose membrane, 0.5 mL sample volume |
Thermo Sorvall Evolution RC Floor Super Speed Centrifuge | Cambridge Scientific | 15566 | |
Beckman Coulter Optima L-90K | GMI | 8043-30-1191 | |
Nunc EasYFlask 175cm2 | Thermofisher Scientific | 159910 | |
Falcon 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Thermofisher Scientific | 14-432-22 | |
25 mL Serological Pipette | Sigma-Aldrich | SIAL1250 | |
10 mL Serological Pipette | Sigma-Aldrich | SIAL1100 | |
DNA lobind tubes | Eppendorf | 30108051 | |
Cold Centrifuge 5810 R | Eppendorf | EP022628188 | for 50 mL tubes |
Orbital Shaking Incubator | Ratek | OM11 | |
Frezco 17 Microcentrifuge | Thermofisher Scientific | 75002402 | |
Eppendorf DNA lo-bind tubes | Merck/Sigma-Aldrich | EP0030108051 | |
Eppendorf® Protein LoBind tubes | Merck/Sigma-Aldrich | EP0030108116 | |
SW 41 Ti Swinging bucket rotor | Beckman-Coulter | 331362 | |
Heracell™ 150i CO2 Incubator, 150 L | Thermofisher Scientific | 51026282 | |
0,3 mL ultra-fine II short insulin syringe | BD Medical | 328822 | |
3 mL syringe with Luer Lok tip | BD Medical | 302113 | |
25 G x 16 mm Hypodermic Needle | Terumo | TUAN2516R1 |