从真核细胞 中快速体内 固定和分离转化复合物

1. 酵母细胞方案 酵母细胞培养和固定注意：细胞固定和收获从10，38经过修改。 在所需条件下（1%w / v酵母提取物，2%w / v，葡萄糖，40mg / L硫酸腺嘌呤（30°C用作示例）中设置1 L酵母细胞培养物（以野生型（WT）在600nm处起始光密度不超过0.05AU（OD 600）的轨道振荡器中培养1 L酵母细胞（以野生型（WT）为例）实验）。 设置具有兼容转子和离心机瓶的制备离心机，用于造粒酵母细胞的液体悬浮培养物。对于葡萄糖饥饿实验，一旦达到600nm处的光密度为0.6-0.8 AU（OD600），使用在30°C，5，000×g下短暂离心1分钟，就沉淀细胞。 注意：记录生长细胞的OD，如果指数生长阶段感兴趣，则让细胞生长，直到OD600 达到0.6-0.8 AU。 立即将沉淀重悬于含有不加入或低（0.25%w / v）的温（30°C）YP培养基中，并在轨道振荡器-培养箱中在30°C下再孵育培养物10分钟。注：介质成分可能会影响后续的交联效率。该协议仅使用YPD进行测试。在进行饥饿实验时，坚持时机并最大限度地减少程序之间的延迟至关重要。 一旦细胞准备就绪，在通风橱内设置一个冰柜，里面有一个装有250克干净碎水冰的烧杯。确保在烟罩内可接触到 25 mL 条带和新购买的甲醇稳定 37% w/v 甲醛溶液。将1升培养物倒入装有25%w / v碎水冰的烧杯中。注意：除非另有说明，否则在整个后续操作中将细胞保持在冰上，直到细胞被冷冻。 加入75 mL 37%w / v甲醛溶液至2.2%w / v的最终浓度，并强烈搅拌混合物直至冰融化。 冰融化后，设置一个计时器10分钟。注意：坚持推荐的时间和温度方案，以获得可重复的固定结果。 孵育10分钟后，将培养物转移到预冷的离心机瓶中，并通过在4°C，5，000×g下离心5分钟来沉淀细胞。 当旋转开始时，将50 mL管预冷，并将新鲜制备的缓冲液A（含有甘氨酸以中和任何剩余的甲醛）放在冰上。注：有关确切的缓冲液成分，请参阅提供的表格。 离心后，将离心管放在冰上，沉淀面与冰接触。将管子带入通风橱，并将上清液丢弃到甲醛废物容器中。 使用25 mL条带将所有管中的细胞沉淀重悬于20mL缓冲液A中，并转移到50mL管中。注意：这种洗涤对于避免不可重复的交联至关重要，并且缓冲液的添加不得超过细胞收获后的20分钟。 用缓冲液A使体积达到40mL，并通过在4°C，5，000×g下离心5分钟收集洗涤的细胞。 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于40mL缓冲液A1（不含甘氨酸的缓冲液A）中以除去任何甘氨酸污染。 通过在4°C，5，000×g下离心5分钟再次沉淀细胞。 用缓冲液A1重复洗涤一次。弃去上清液并将细胞沉淀放在冰上。用沉淀称量管（湿细胞质量应为每1L细胞培养物〜1g）。 酵母细胞破碎和细胞质基质收集 用液氮填充衬有铝箔的聚苯乙烯泡沫盒，深度约为3厘米。将 50 mL 试管直立放入包装盒中。 通过移液和涡旋10s将沉淀（约1g湿细胞质量）重悬于550μL缓冲液A2中。加入10μL的40 U / μL RNase抑制剂并再次涡旋10秒。注意：处理液氮时，请穿戴适当的防护装备，如隔热手套。确保任何用于容纳液氮的容器不会泄漏，并且内部的管架不会漂浮或侧落。在通风良好的区域工作，以避免氧气耗尽。 使用1 mL移液器，将细胞悬浮液滴入含有液氮的50 mL管中。注意：滴落必须缓慢而小心地进行，以避免液滴聚集。在引入新液滴之前，确保液滴冻结。 将带有冷冻细胞悬浮液滴的50mL管转移到室温，并等待液氮完全蒸发。用盖子密封管并将细胞沉淀储存在-80°C或立即进一步进行。注意：在密封管子之前，请确保液氮完全蒸发。密封管中残留的液氮会导致危险的压力积聚。 为了准备下一步，在干冰上预冷却1.5 mL无核酸酶管和10 mL不锈钢研磨罐。 使用干净，无菌的刮刀将冷冻的细胞悬浮液滴转移到罐中。注意：确保研磨罐密封牢固。 将研磨罐浸入液氮中1分钟，确保液相保持在液结下方。设置一个27 Hz的冷冻混合器研磨机进行搅拌1分钟。注意：即使样品只需要一个研磨罐进行处理，也要始终将研磨罐与同一型号的另一个研磨罐进行平衡。 在混合器研磨机中以27 Hz搅拌密封的研磨罐1分钟。 像以前一样在液氮中重新冷却研磨罐，并在混合器研磨机中以27 Hz进一步摇动1分钟。 将罐子与1.5 mL无核酸酶管一起转移到装有干冰的冰盒中。使用小钢刮刀，将所得粉末状样品转移到〜100mg等分试样的管中，并将管储存在-80°C。注意：建议每个实验使用约600mg的样品，包括多体沉降谱分析，将细胞质基质分离成翻译和非翻译的组分，以及在RNase消化后将翻译的组分进一步分离成SSU，核糖体和二组分。 从细胞质基质的非翻译部分分离固定（多）核糖体复合物注：先前确定的程序10,38通常遵循基于其与（多）核糖体共沉降来富集翻译的RNA。这里介绍了一种更精细的方法来分离翻译和非翻译的细胞质基质组分，从而无需沉淀并随后重新溶解材料。使用冻融法43在薄壁超速离心管（5 mL，13 x 51 mm）中制备2.5 mL线性10%-20%w / v蔗糖梯度，使用缓冲液B。注意：冻融法是通过连续添加和冷冻缓冲蔗糖层来执行的，其浓度彼此线性递减。有关详细信息，请参阅补充表 1。 为了形成不连续的50%w / v蔗糖垫，在线性梯度解冻和稳定后，使用1 mL注射器将缓冲液B中的0.5mL 50%蔗糖缓慢分配到管的底部，该注射器连接到19 G x 1.5″针头或类似/合适尺寸的玻璃毛细管。在分配之前，小心而缓慢地将针尖或毛细管从预先形成的蔗糖梯度的顶部驱动到底部，避免任何干扰，直到它到达管底部。注：有关缓冲液B制备的说明，请参见补充表1。 通过去除顶部部分或在缓冲液B中分层更多的10 w / v蔗糖并保持冰冷或4°C，仔细平衡梯度。注意：需要底部50%蔗糖层的不连续梯度来收集沉降率较高的材料，而不会将其沉淀在管壁上。 在室温下解冻〜100mg冷冻细胞粉末样品并立即置于冰上。通过移液在150μL缓冲液A2中混合，将RNase抑制剂加入1 U / μL并通过涡旋混合（避免过度发泡并与气相混合）混合10秒。注意：除非另有说明，否则在将材料放在冰上的同时继续所有操作。 通过将管在4°C，13，000×g下离心5分钟来沉淀细胞碎片，并在新的1.5mL低蛋白结合管中回收澄清的上清液（〜150μL）。 将所得的澄清混合物加载到步骤1.3.3的不连续蔗糖梯度管上，并仔细平衡它们。 在4°C下将管子在中等体积的摆动桶转子中超速离心，平均重力为287，980 x g（k 因子49）1小时30分钟。注意：这些条件已经过预先优化（使用超速离心梯度紫外吸光度痕量分析），以将游离（非（多）核糖体）SSU和LSU（大核糖体亚基）保留在梯度的顶部（10%-20%蔗糖）部分，同时浓缩底部（50%）蔗糖垫中的（多）核糖体部分而不造粒材料。 使用配备19 G x 1.5″针头的新型无菌1 mL注射器收集翻译的细胞质基质组分。将 5 mL 梯度放在稳定的支架上，确保试管底部可见。 从试管的顶部，将针头直接插入梯度的底部（不刺穿试管），轻轻地，不产生任何气泡，取出含有翻译的RNA池的底部溶液的0.5mL。注意：确保在冷室中执行此步骤，并牢固地握住管子。建议在单次上冲程运动中绘制整个0.5 mL，以避免梯度的干扰。 通过超速离心运行时蔗糖梯度的吸光度读数，确认（多）核糖体的存在以及所得混合物中SSU，LSU和较轻馏分的耗尽。 使用具有10 kDa截止再生纤维素膜的微量浓缩装置中的超滤将上一步收集的翻译RNA池浓缩至100μL。注意：用0.5 mL缓冲液1预洗微浓缩装置的膜（见图2a），并使用制造商推荐的旋转条件（g）。 用缓冲液1进一步稀释上一步中的材料五次（加入400μL），并浓缩回200μL，以允许更小的体积以及部分去除蔗糖。注意：建议将所得混合物在-80°C下储存长达6个月，并用作”总翻译RNA”RNA-seq文库构建的输入材料，或TCP-seq文库构建的RNase消化步骤。”非翻译”细胞质基质组分可以使用类似的程序从梯度顶部回收并储存在-80°C。 RNase消化固定（多）核糖体复合物并将消化物质分离成小核糖体亚基（SSU），单核糖体（核糖体，RS）和双核糖体（二组，DS）级分注意：该过程通常遵循前面描述的方法10,38但是采用了改进的梯度类型，分离时间，加速度和RNase消化条件，以在所有三个分离的馏分上实现最佳分辨率。使用步骤1.3.1中描述的冻融方法43，用缓冲液1在13 mL薄壁聚丙烯管中制备精心平衡的12.5 mL线性10%-40%w / v蔗糖梯度，14 x 89 mm，并注意其中。 在室温下解冻并立即将样品转移到冰上或取步骤1.3.12中浓缩和蔗糖耗尽的翻译细胞质组分。注意：除非另有说明，否则在冰上继续所有程序。 通过在23°C下混合4.5U 大肠杆菌 RNase I每1 OD260 单位的馏分30分钟来消化翻译的细胞质基质组分。 通过移液能够使RNase I失活的RNase抑制剂立即加入并混合至0.25 U / μL到混合物中，以使RNase I失活。注意：使用能够抑制RNase I的RNase抑制剂，通过使用AU260 =（260nm处的吸光度标准化为相当于1cm光程x以μL为单位的裂解物体积）/ 1，000来获得AU260。 立即将样品转移到冰上。注意：坚持推荐的消化条件并仔细测量添加的RNase I的量至关重要。这里提到的RNase I单元被定义为在37°C下30分钟内从小鼠肝脏RNA产生1μg酸溶性物质所需的酶量。如果酶储备物过于浓缩，建议用缓冲液1稀释，以避免移液非常小体积的溶液。 将反应混合物加载到步骤1.4.1的10%-40%w / v蔗糖梯度上。注：使用最终体积，每个梯度为150-300 μL。每次纯化至少需要两个梯度。使用不同输入体积的材料（较低的AU 260，10-11 AU260，用于DS，相对较高的AU260，13-14AU260，用于SSU或RS）以实现最佳分离。 在中等体积的摆动桶形转子中，在4°C下超速离心管，平均重力为178，305 x g（k 因子143.9）3小时30分钟。注意：如果需要备用平衡管，请使用含样品管平衡其质量和质量分布。使用备用蔗糖梯度覆盖，其缓冲液量相当于样品覆盖量，而不是蔗糖浓度均匀的试管。 在超速离心离心旋转完成前至少30分钟设置梯度分馏器装置，包括将0.2μm过滤的重追逐溶液（例如，此处使用的去离子水中含有60%蔗糖）填充到排量泵中。注意：建议使用去离子水去除分馏器的管路和管道，然后在运行前后在去离子水中加入1%-2%SDS溶液，去离子水，最后在去离子水溶液中加入80%乙醇。 调整吸光度读数基线，首先用去离子水填充系统并根据制造商的建议将光学器件归零，然后使用备用的卸载的14 x 89 mm蔗糖梯度补偿基线，该缓冲液由与样品管相同的缓冲液（例如，缓冲液1）制成。注：使用与样品读数相同的位移速度进行调整，例如1.5 mL/min。 通过精确计算溶液首先进入检测器的光路到首先出现在馏分收集器输出端之间的时间，测量位移系统死体积。注意：推荐速度为 1.5 mL/min 时，可在室温下进行分馏。建议立即将收集到的馏分转移到冰上。 使用 254 nm 的活吸光度读数、1.5 mL/min 置换速度以及基于样品的预期沉降位置和吸光度曲线的在线馏分检测进行分馏。使用与之前测量的死体积相对应的时间延迟的收集管切换。 分离与SSU，RS和DS复合物的位置和迁移率相对应的级分，并将它们收集到新的低蛋白结合1.5mL微量离心管中;立即将分离的馏分转移到冰上，如果不立即进一步处理，则将其冷冻。注意：建议立即将收集的馏分在干冰或液氮中闪冻，并在-80°C或以下的温度下储存长达6个月。 核糖体复合物的脱交联和RNA的分离以构建RNA-seq文库 为了去嵌段/逆转交联并将RNA从相关蛋白质中分离出来，将大约一半的整个蔗糖梯度级分转移到带有盖子安全/锁定装置的新型低核酸结合无核酸酶聚丙烯1.5mL微量离心管（每管350μL）中。 用40μL100%停止溶液（10%SDS w / v和100mM EDTA），4μL1 M Tris-HCl pH 2在25°C（至10mM）下补充混合物，1.6μL2.5M甘氨酸（至10mM）和去离子无核酸酶水，以获得最终体积为400μL。 通过移液混合试管的内容物，并在室温下转移试管。 向每个管中加入等体积的酸性苯酚：氯仿：异戊醇125：24：1（pH 4.0-5.0）混合物。使用设置为最大速度的涡旋混合器用力摇动混合物2分钟。注意：苯酚和氯仿具有腐蚀性和毒性。避免与液体发生物理接触，并在通风良好的区域或通风橱下工作。使用苯酚或氯仿时，请务必使用手套、实验服和护目镜或面罩。 将管子放入热塑轮中，在65°C，1，400 rpm下连续摇动30分钟。 通过在室温下以12，000×g离心混合物10分钟来促进相聚集。 收集上层水相并将其转移到新鲜的低核酸结合1.5mL管中。注：为避免交叉污染，请勿尝试完全回收水相。合理的回收量为300-350μL。 用0.1体积的3M乙酸钠（25°C时pH 5），20μg糖原（使用5μg/ μL储备）和2.5体积的无水乙醇补充收集的水相。通过涡旋管1分钟小心地混合溶液。 通过将样品在-20°C下孵育至少2小时（推荐过夜）来沉淀RNA。 将管加热到室温并通过涡旋混合。注意：试管的预热和随后在室温下离心（无需强制冷却）有助于减少盐和苯酚的共沉淀和残留。如果按照所述进行并使用足够纯的乙醇，这些条件不应导致材料损失或RNA收集效率低下。 通过在室温下以12，000×g离心管30分钟来沉淀RNA沉淀。 弃去上清液并用80%v / v乙醇洗涤沉淀两次，每次通过在室温下以12，000×g离心10分钟收集。 通过打开管盖并将打开的管放入设置为45°C的干块加热器中10分钟来干燥RNA沉淀。将所得的干燥沉淀溶解在20μL的1x HE缓冲液中。 使用紫外吸光度光谱测量估计所得的RNA浓度。注意：RNA片段长度和总量可以使用变性凝胶电泳进一步评估，例如在基于荧光的自动毛细管凝胶电泳装置中。 通过标记的eIF和选择性SSU富集的蛋白质印迹分析对SSU进行选择性共免疫纯化注意：使用步骤1.4.11中约15 AU（260nm）的消化和沉降分离的SSU馏分，使用磁性IgG磁珠进行亲和纯化。保存约5%的SSU分数作为输入控制（输入分数，I）。eIF4A标记 （TIF1-TAP;使用串联亲和纯化标签）酵母菌株，这也使得通过使用抗TAP抗体探测TAP标签来检测eIF4A成为可能。将100μL磁性IgG微球悬浮液（每15 AU（260nm）裂解物或馏分使用1mg微球）转移到新的低蛋白结合1.5mL管中;使用磁性架收集珠子并吸出它们。 使用1 mL缓冲液1洗涤磁珠两次，方法是使用移液和收集的顺序重悬，并使用磁性支架收集。 洗涤后，收集并倾倒珠子，同时将它们放在磁性架上。 将SSU馏分加入洗涤的珠中，并将混合物在4°C下旋转，在约20rpm的环形混合器中孵育4小时。 在4°C下使用磁性架收集磁珠并保存上清液（流通分数，FT）。 用补充有4mM DTT的缓冲液1在4°C下洗涤珠子两次，每次在循环混合器中旋转10分钟，并在磁性架上收集和倾倒珠子。保存洗涤液（W1 和 W2 分数）。 对于分析应用（如蛋白质印迹），通过加入LDS（十二烷基硫酸锂）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）样品缓冲液，pH值为8.5至1x，DTT至2mM，在变性和还原条件下洗脱结合材料。 在热块中将混合物在95°C下加热5分钟以完成洗脱。 使用磁架收集微珠，并在新鲜的低蛋白结合1.5mL微量离心管中回收变性洗脱液（E级分）。 使用上一步中的E级分立即运行变性十二烷基硫酸钠（SDS）PAGE，或将E级分储存在-20°C。注意：对于任何后续应用，对于TAP标签富集的转化复合物的制备性收集，请使用采用烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶的替代洗脱方法。有关更多详细信息，请参阅补充表 1。 为了浓缩稀释的FT，W1和W2馏分，通过加入3倍体积的冰冷丙酮来沉淀其物质。将样品 – 丙酮混合物在-20°C孵育3小时。 通过在4°C下以13，000×g离心管10分钟来沉淀沉淀。 弃去上清液，并在室温下在打开的管中风干沉淀30分钟。 将沉淀溶解在7μL的1x LDS上样缓冲液中，并补充2mM DTT。将样品在设置为95°C的热块中加热5分钟。 将所有I，FT，W1，W2和E样品加载到4%-12%w / v丙烯酰胺梯度，双-Tris聚丙烯酰胺变性凝胶上。使用1x MES SDS（2-[N-mopholino]乙烷磺酸，十二烷基硫酸钠）在80 V下电泳缓冲液运行凝胶，直到蛋白质标记物（10-250 kDa）解析良好并且铅染料到达凝胶底部。注意：建议在凝胶上加载WCL（全细胞裂解物）（2-10μg）的连续稀释液作为对照。可能需要多次尝试才能在馏分材料上实现凝胶的可比负载。 按照蛋白质印迹设备制造商的建议，通过湿转方法在100 V下在冷室中将凝胶的蛋白质含量转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上1小时。 在恒定振荡下，使用适当的封闭缓冲液（基于磷酸盐缓冲液）在室温下阻断膜1小时。 按照制造商的抗体稀释说明，在冷室中用封闭缓冲液（PBS）稀释的抗体（1：1，000稀释）在膜上孵育过夜，用抗TAP抗体探测膜，用于检测标记的eIF4A蛋白，抗Pab1p抗体或抗β肌动蛋白抗体（或任何其他理想的靶标）。注意：1：1，000抗体稀释液是一个很好的起点。 用1x磷酸盐缓冲盐水洗涤膜三次，每次0.2%v / v吐温20（PBST）10分钟。 按照制造商的说明，通过在室温下在环混合体中孵育1小时，用荧光标记的二抗探查膜。注意：1：20，000抗体稀释是一个很好的起点。 用1x PBST洗涤膜三次，每次10分钟。用去离子水短暂冲洗膜，然后用无水甲醇冲洗。根据制造商的说明，在荧光成像系统中干燥并可视化膜。注意：其他蛋白质的染色可以通过使用具有匹配不同荧光通道的染料的二抗来实现（例如，在eIF4A-TAP 与 此处使用的β-肌动蛋白对中），通过顺序染色或剥离并染色相同的膜或从装载有重复级分图案的凝胶中切割膜，并用各自的抗体单独探测每块（如此处使用的Pab1p示例所示）。 2. 哺乳动物细胞方案 哺乳动物细胞培养和固定 在2个T-175烧瓶中，在Dulbecco的改性鹰培养基和37°C和5%v / v二氧化碳下将HEK293细胞培养至60%-70%汇合，10%v / v胎牛血清。注：将55 mL商用FBS加入500 mL商用DMEM中，含有L-谷氨酰胺，酚红和碳酸氢钠，但不含HEPES或丙酮酸钠，从而制成完整的培养基。在70%汇合时，每个T-175烧瓶的细胞计数应在1.7-2.0 x 107的范围内。 在所需固定时间前至少3小时，用精确30 mL预热的完整培养基替换T-175烧瓶的培养基，并更换细胞培养箱中的烧瓶。注意：确保将新鲜培养基移液到烧瓶的另一侧，以达到细胞单层，以避免细胞脱离。尝试尽快进行介质交换，引入最小的气体和温度平衡干扰。 更换细胞培养基后，准备固定所需的缓冲液和化学品。通过将10.2毫升2.5米甘氨酸储备液加入500毫升DPBS瓶中并混合，用50 mM甘氨酸制备Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）。 按照步骤2.1.1准备一瓶补充有10S的DMEM，用于非无菌条件和100毫升0.25%胰蛋白酶-EDTA等分试样。采购另一瓶用氯化钙（CaCl2）和氯化镁（MgCl2）预先配制的商用DPBS。注意：溶液可以在4°C下储存长达2周。 准备一个装满碎水冰的冰盒，使T-175烧瓶可以均匀地放在顶部，并与准备好的缓冲液一起保持在通风橱中，也可以放在冰上。注意：由于翻译对任何环境变化的快速反应，必须最小化从培养箱中取出细胞烧瓶和加入甲醛溶液之间的所有时间。 为了使细胞快速冷却，请从培养箱中取出T-175烧瓶，并将其牢固地压在冰上，以确保最大的表面接触。在化学通风橱内，将烧瓶倾斜到其侧面，以便培养基聚集在与细胞相反的一侧。将168μL37%w / v甲醛直接移入混合培养基中（最终浓度为0.2%w / v）。通过轻轻地来回摇动烧瓶，关闭烧瓶并将其重新定位在冰上，确保其水平并且细胞均匀覆盖，立即混合。注意：甲醛是一种有害物质，具有潜在的长期不良反应，对呼吸系统和皮肤也有刺激性。它只能在合适的化学通风橱中处理。甲醛容器在通风橱外时必须始终密封。注意：确保将甲醛直接添加到细胞培养基中，而不是添加到烧瓶壁中。步骤2.1.6应少于1分钟。 将烧瓶在冰上再孵育10分钟。将培养基倒入适当的废物容器中，通过与细胞相对的烧瓶侧。 使用条带，在30 mL Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水中移液，不含钙和镁离子，另外含有50 mM甘氨酸，轻轻地放在与细胞相反的一侧。通过摇动烧瓶混合;将烧瓶放回水平位置，并在冰上再孵育10分钟。 通过与细胞相反的烧瓶侧倒出溶液，轻轻加入7mL标准0.25%w / v胰蛋白酶-EDTA溶液以分离和重悬细胞。将烧瓶在室温下孵育5-10分钟。注意：确保胰蛋白酶-EDTA溶液均匀覆盖所有细胞。使用周期性的轻柔倾斜和摇摆来促进细胞脱离。 垂直放置烧瓶，并使用条带通过轻轻地从烧瓶壁上清洗任何剩余的细胞来收集分离的细胞。将悬浮液转移到冰上的50 mL管中。注意：固定细胞会变得更加脆弱;不要用力移液或超过将细胞从烧瓶壁上分离所需的量程。 立即用20mL完整培养基（具有10S的非无菌冰冷培养基）补充收集的细胞悬浮液，并通过轻轻翻转管子混合。注意：加入完整的细胞培养基（包括10S）以中和胰蛋白酶，防止进一步损伤细胞膜和细胞崩解。 通过将管以100×g离心5分钟和4°C来沉淀细胞。 细胞沉淀必须清晰可见。 倒出培养基，将细胞沉淀轻轻重悬于10 mL冰冷的DPBS中，其中含有Ca2 +，Mg2 +，不含甘氨酸。 重复步骤 2.1.12。 倒出洗涤缓冲液，将细胞沉淀轻轻重悬于800μL冰冷的DPBS中，其中含有Ca2 +，Mg2 +，不含甘氨酸，在冰上。将重悬的细胞转移到新的低蛋白结合1.5mL微量离心管中。 将管在100×g和4°C下离心3分钟。 使用1 mL移液器小心地丢弃上清液。在此阶段，细胞沉淀可以在-80°C下冷冻或进入细胞裂解步骤。注意：冷冻细胞沉淀可以在-80°C下储存长达1年。我们发现细胞沉淀冷冻有助于随后的裂解，即使没有计划长期储存，也建议冷冻。 哺乳动物细胞破碎和细胞质基质收集 在生物安全柜中，加入300μL基于非离子，非变性洗涤剂的裂解缓冲液和7μL的40 U / μL RNase抑制剂。使用 1 mL 吸头移液充分混合。 小心地将25 G针头连接到1-3 mL注射器上，并使用至少7次缓慢向上进气和快速向下排气冲程大力移取混合物。 将注射器和针头丢弃到尖锐的料仓中，并使用装有31 G针头的0.3 mL注射器重复该过程。 将注射器和针头丢弃到尖锐的垃圾箱中。将管在4°C，12，000×g下离心5分钟以沉淀细胞碎片。 将上清液转移到新的低蛋白结合1.5mL微量离心管中。将细胞碎片（用于控制目的）和所得澄清的细胞裂解物在-80°C下储存。注：当两个T-175烧瓶组合并遵循推荐体积时，裂解物的光密度范围在25-30 AU260 之间。裂解物和细胞碎片可以在-80°C下储存长达1年。 从细胞质基质的非翻译部分分离固定（多）核糖体复合物 在13 mL薄壁聚丙烯管中制备线性15%-45%w / v蔗糖梯度，14×89 mm，使用冻融方法，通常如酵母方案的步骤1.3.1中所述，但使用缓冲液2（图2a）。注意：在分馏前一天晚上，在4°C的冷室中解冻梯度过夜。 将150-250（最大300）μL细胞裂解物从前一步2.2.5加载到平衡梯度上。将剩余的裂解物储存在-80°C并用于控制目的。注：这里提供了一个基于沉降的分离成多体、核糖体和”游离”SSU级分的例子。有关替代方法，请参阅提供的补充表1。 在中等体积的摆动桶形转子中，在4°C下超速离心管，平均重力178，305 x g（k 因子143.9）1小时45分钟。 在离心完成前30分钟，设置梯度分馏器并基线，如酵母方案步骤1.4.7-1.4.9中所述。 分馏梯度通常如酵母协议步骤1.4.10-1.4.11中所述。注意：此步骤将分离多体、核糖体和”游离”SSU 级分。多体组分可用于多体分析实验。 立即将收集的馏分转移到冰上，如果没有进一步处理，请在-80°C下储存长达6个月。注意：如果馏分收集管更换与在线馏分鉴定和分离同步，我们建议使用最多800 μL级分（在1.5 mL/min下，每馏分的收集时间为32秒）。如果在不使用在线吸光度读数的情况下进行分馏，则建议使用250-500μL级分（每馏分10-20秒，1.5 mL / min）。分离后，这些级分可用于免疫纯化、电子显微镜检查、变性 PAGE 和立即进行蛋白质印迹，或进行交联逆转以进行后续的 RNA 和/或蛋白质组学分析。